2004 Fiscal Year Annual Research Report
自身の発現密度に依存するイオンチャネル・受容体の機能と構造の動的変化の解析
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16390052
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
久保 義弘 生理学研究所, 分子生理研究系, 教授 (80211887)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 主税 産業技術総合研究所, 脳神経情報研究部門, グループ長 (00357146)
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| Keywords | ATP受容体チャネル / P2X2 / 単粒子構造解析 / バキュウロウイルス / Sf9細胞 |
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| Research Abstract |
我々は、ATP受容体チャネルP2X2のポアのイオン選択性等の性質が、細胞膜上での発現密度に依存して劇的に変化することを見いだした(Fujiwara and Kubo, J.Physiol.(2004))。この知見は、P2X2受容体チャネルに、状況に依存して著しい構造変化が起こることを示唆する。しかし、現時点でP2X2受容体チャネルの立体構造は明らかにされておらず、ストイキオメトリーについてさえ、決定的な結論は出ていない。P2X2受容体チャネルの動的構造変化を知るというゴールに向け、今年度、我々は、単一粒子構造解析によりアプローチすることを目的としてP2X2受容体チャネル蛋白の精製を行った。
まず、P2X2のN-もしくはC-末端にFLAG tagを付加したコンストラクトを作成し、ツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学的解析により、正常な機能を持つことを確認した。その後、cDNAをバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞Sf9に感染させ、免疫細胞化学的に細胞膜上での蛋白発現を確認した。大量スケールでの感染Sf9細胞を回収し、膜画分を50mM dodecyl-β-maltosideを含む溶液で可溶化し、FLAG抗体を含むゲルによりアフィニティ精製した。SDS-PAGEの銀染色により単一のmajor bandを確認した後、ゲル濾過により精製した。そのピーク分画を、酢酸ウランにより負染色して電顕撮影したところ、単一蛋白粒子と思われる像が観察され、3量体であることが示唆された。
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