哺乳類卵活性化精子蛋白質候補ホスホリパーゼCゼータの検証と機能解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390055
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 宮崎 俊一 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (80010081)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 昌彦 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (50385423) ; 淡路 健雄 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (60297546) ; 白川 英樹 電気通信大学, 電気通信学部, 助教授 (40241070) ; 尾田 正二 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 講師 (50266714)
• Keywords: 受精 / 細胞内カルシウムイオン / 哺乳動物卵 / カルシウムオシレーション / 精子細胞質因子 / 卵活性化蛋白質 / ホスホリパーゼCゼータ / 核移行能

Research Abstract

哺乳動物卵の受精時には細胞内カルシウムイオンの反復性の増加(Ca^<2+>オシレーション)が起こり,卵活性化(第二減数分裂の再開,第二極体の放出,雌雄前核の形成)の引き金になる.Ca^<2+>の増加はイノシトール3リン酸(IP_3)受容体を介する小胞体からのCa^<2+>遊離による・精子細胞質にCa^<2+>オシレーション誘起物質,即ち卵活性化蛋白質(Egg Activating Protein, EAP)が存在し,精子一卵融合時に卵内に移入する.本研究はEAPの有力候補であるIP3産生酵素ホスホリパーゼCの新タイプ,ゼータ(PLCζ)の特性を解析し,EAPであるか否かを検証することを目的としている.本年度はPLCζの分子構造と機能の関連,動物種間の差,遺伝子欠損マウスにつき,以下の結果を得た.
1)PLCζ分子の1個1個のアミノ酸置換変異体,ドメイン削除変異体を作成し,これに蛍光蛋白Venusを結合した蛋白質をコードするRNAをマウス卵に注入して強制発現させ,Ca^<2+>オシレーション誘起能と核移行能をアッセイした.2)触媒ドメインX,Yの連結部位に核移行配列があること,EF1ドメインおよびXドメインにも核移行に必須なアミノ酸配列があること,N末端のEF1ドメインとC末端のC2ドメインが会合するような立体構造が必須であることを明らかにした.3)核移行できないPLCζを発現させると,前核形成時にCa^<2+>オシレーションが停止いないことを示した.4)マウスPLCζは核移行するが,ラット・ヒト・メダカのPLCζは核移行しないことを認めた.5)PLCζ欠損精子で受精時の卵活性化阻害を確認するため,PLCζの遺伝子ノックアウトマウスを作成した.現在PLCζ欠損精子で媒精した卵にCa^<2+>オシレーションが起るか否かを検査中である.6)機能的な相補性を確認するため,PLCζトランスジェニックマウスを作成した.

Research Products

• [Journal Article] Measuremenr of intracellular IP, during CA^<2+> oscillations in mouse Eggs with GTP-based FRET probe (2006)
  • Author(s): Shirakawa, H., Ito, M., Sato, M., Umezawa, Y., Miyazaki, S
  • Journal Title: Biochemical and BIophysical Research Communications 345 Pages: 781-788
• [Journal Article] The role of X/Y linker region and N-terminal EF-hand domain in nuclear translocation and Ca^<2+> oscillation-inducing activities of phospholipase C a mammalian egg-activating factor (2006)
  • Author(s): Kuroda, K., Ito, M., Shikano, T., Awaji, T., Yoda, A., Takeuchi, H., Kinoshita, K., Miyazaki, S.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 281 Pages: 27794-27805