RhoファミリーG蛋白群の時空間的制御機構の解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390078
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 道行 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (10199812)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 黒川 量雄 (独)理化学研究所, 中野生体膜研究室, 研究員 (40333504)
• Keywords: Rho / FRETプローブ / 上皮細胞増殖因子

Research Abstract

上皮細胞増殖因子によるRhoファミリーG蛋白の活性制御機構を引き続き研究した。上皮細胞増殖因子により活性化されRhoファミリーG蛋白の活性化を誘導するグアニンヌクレオチド交換因子を同定するために、RNAiにて遺伝子をノックダウンし、その細胞にFRETプローブを発現させて、上皮細胞増殖因子依存性のRhoファミリーG蛋白活性化因子を同定するという実験を行った。まず、RNAiのノックダウン効率が高く、かつ上皮細胞増殖因子依存性のRhoファミリーG蛋白の活性変化が見やすい細胞をスクリーニングした。その結果、A431細胞がもっとも適していることがわかったので、この細胞をさらにサブクローニングして、安定した実験系を確立した。この細胞において、現在までに6種類のG蛋白活性化因子をRNAiでノックダウンし、上皮細胞増殖因子依存性RhoファミリーG蛋白の活性変化を観察した。すでに、このうちの一つにおいて、上皮細胞増殖因子依存性のRho不活化およびRac活性化が阻害されるという結果を得ている。そこで、この分子が上皮細胞増殖因子の刺激によりどのような変化を受けるか解析したところ、上皮細胞増殖因子依存性にチロシンリン酸化されることがわかった。そこで、現在、このチロシンリン酸化部位に対する抗体を作成し、その意義について解析中である。また、このグアニンヌクレオチド交換因子が上皮細胞増殖因子依存性にどのような構造変化を受けるか、そしてチロシンリン酸化は構造にどのような影響を与えるかを解析するために、この分子の構造変化を解析するためのFRETプローブを作成した。最終年度にこれらの結果をまとめて、上皮細胞増殖因子依存性にRhoファミリーG蛋白の活性が制御されるメカニズムを発表する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. (2006)
  • Author(s): Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M.
  • Journal Title: Cancer Sci. 97 Pages: 8-15
• [Journal Article] Dynamics of the RAS/ERK map kinase cascade as monitored by fluorescence probes. (2006)
  • Author(s): Fujioka, A., terai, K., Itoh, R.E., Aoki, K., Nakamura, T., Kuroda, S., Nishida, E., Matsuda, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. (In press)
• [Journal Article] Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 plays an essential role for Toll-like receptor (TLR)7- and TLR9-mediated interferon-{alpha} induction. (2005)
  • Author(s): Uematsu, S., Sato, S., Yamamoto, M., Hirotani, T., Kato, H., Takeshita, F., Matsuda, M., Coban, C., Ishii, K.J., Kawai, T., Takeuchi, O., Akira, S.
  • Journal Title: J.Exp.Med. 201 Pages: 915-923
• [Journal Article] FRET imaging in nerve growth cones reveals a high level of RhoA activity within the peripheral domain. (2005)
  • Author(s): Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Mol.Brain Res. 139 Pages: 277-287
• [Journal Article] Monitoring spatio-temporal regulation of Ras and Rho GTPase with GFP-based FRET probes. (2005)
  • Author(s): Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Methods 37 Pages: 146-153
• [Journal Article] Localized RhoA Activation as a Requirement for the Induction of Membrane Ruffling. (2005)
  • Author(s): Kurokawa, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Mol.Biol.Cell 16 Pages: 4294-4303
• [Journal Article] Mechanism and role of localized activation of Rho-family GTPases in growth factor-stimulated fibroblasts and neuronal cells. (2005)
  • Author(s): Kurokawa, K., Nakamura, T., Aoki, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Biochem.Soc.Trans. 33 Pages: 631-634
• [Journal Article] Involvement of the c-Src-Crk-C3G-Rap1 signaling in the nectin-induced activation of Cdc42 and formation of adherens junctions. (2005)
  • Author(s): Fukuyama, T., Ogita, H., Kawakatsu, T., Fukuhara, T., Yamada, T., Sato, T., Shimizu, K., Nakamura, T., Matsuda, M., Takai, Y.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 815-825
• [Journal Article] Ras binding opens c-Raf to expose the docking site for MEK. (2005)
  • Author(s): Terai, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: EMBO Rep. 6 Pages: 251-255
• [Journal Article] A FRET-based probe for epidermal growth factor receptor bound non-covalently to a pair of synthetic amphipathic helixes. (2005)
  • Author(s): Itoh, R.E., Kurokawa, K., Fujioka, A., Sharma, A., Mayer, B.J., Matsuda, M.
  • Journal Title: Experimental Cell Research 307 Pages: 142-152
• [Journal Article] Local PIP3 accumulation recruits Vav2 and Vav3 to activate Rac1/Cdc42 and initiate neurite outgrowth in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. (2005)
  • Author(s): Aoki, K., Nakamura, T., Fujikawa, K., Matsuda, M.
  • Journal Title: Mol.Biol.Cell 16 Pages: 2207-2217