エピジェネティクスによる小児アレルギー疾患の病態へのアプローチ

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390295
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 森川 昭廣 群馬大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (40125878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒川 浩一 群馬大学, 医学部, 講師 (50272232)
• Keywords: メチル化 / IL-12 / CD14 / 樹状細胞 / アレルギー疾患 / 臍帯血

Research Abstract

本研究は、DNAメチル化による遺伝子発現制御に着目し、アレルギー性疾患における関与を解明することを目的としている。中でもアレルギー疾患におけるTh1/Th2分化の病態に迫るために、Th細胞分化を決定する樹状細胞でのIL-12とIFN-g、またTh細胞におけるIL-4とIFN-gに着目し、アレルギー患者の樹状細胞およびナイーブTh細胞を単離し、それぞれIL-12、IFN-g、IL-4遺伝子座のDNAメチル化の程度をbisulphite法にて測定し、健常者および臍帯血との間に差があるかを検討する。
方法および結果:成人アレルギー患者、健常人の末梢血20mlおよび臍帯血20〜50mlより、比重遠心法にて単核球を分離、CD14陽性分画を磁気ビーズ細胞分離システム(MACS)を用いて精製し、単球を分離しゲノムDNAを採取し、IL-12p35遺伝子転写調節領域におけるDNAメチル化の頻度をbisulphite法を用いて検討した。アレルギー疾患の1検体および臍帯血1検体をbisu 1 phite処理し転写調節領域の近位部位3カ所につきPCR後、泳動切り出しし、Tヴェクターにインサート後大腸菌に形質転換して培養し、それぞれ5コロニーずつ拾い振盪培養し、プラスミド抽出後シークエンスした。結果全370ヵ所のCpG配列に一箇所もメチル化部位を確認できなかった。そこでCpG配列のシトシンをメチル化するSssIメチラーゼ酵素処理後にbisu 1 phite処理をおこないシークエンスし、すべてのCpG配列にメチル化を確認したことで、いわばbisu 1 phite処理のポジティブコントロールを得た。
今後の予定:引き続きアレルギー群、コントロール群および臍帯血それぞれ5検体につき、上記の部位についてメチル化頻度を確認し、各群間でメチル化の頻度に差があるかを検討する。