毛包バルジ幹細胞への遺伝子導入による常染色体劣性遺伝性魚鱗癬の新規治療戦略の開発

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390312
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 秋山 真志 北海道大学, 病院, 講師 (60222551)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 清水 宏 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00146672) ; 澤村 大輔 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (60196334)
• Keywords: バルジ / 幹細胞 / 魚鱗癬 / 遺伝子治療 / 毛包 / マウス

Research Abstract

1)導入リポーター遺伝子の作成:アデノウイルスを用いる系では、COS-TPC法に基づいて行った。レトロウイルス系では、pDON-A1ベクターにGreen fluorescent protein(GFP)遺伝子およびlacZ遺伝子等のリポーター遺伝子を組み込み、パッケージング細胞に導入し、組み換えウイルスを得、導入に用いた。
2)in vitroの系におけるバルジ幹細胞幹に対する遺伝子導入実験:マウス鬚毛包からバルジ部位を切り取りprimary cultureを行った。得られたバルジ由来の培養細胞に対して、上記1)で作成した導入遺伝子のトランスフェクションを行った。
3)in vivoの系におけるバルジ幹細胞への遺伝子導入実験:上記1)2)において、決定されたバルジの幹細胞に対して遺伝子導入効率のよいベクター、導入条件を用いて、マウスの毛包のバルジを目標としてin vivoで遺伝子導入をおこなった。
4)ヒト正常皮膚移植マウスの作成:正常ヒト皮膚(毛包を含む)をヌードマウスに移植し、その後の遺伝子導入実験に用いた。
5)移植ヒト皮膚への遺伝子導入:上記1)で作成したGFPまたはLacZのリポーター遺伝子をCMV-IEプロモーター、あるいはケラチン14等のプロモーターの下流に入れた遺伝子を、上記、実験1)2)3)の結果から最適と決定された導入ベクター、および、導入条件で、naked DNA法、および、徐放性高分子粒子を用いた方法の両方で、移植ヒト皮膚への遺伝子導入実験をおこなった。
6)遺伝子治療実験用導入遺伝子の作成:正常TGM1導入遺伝子の作成:上記1)での導入遺伝子作成に準じ、ヒトトランスグルタミナーゼ1遺伝子(TGM1)とリポーター遺伝子の両方を組み込んだ導入遺伝子、および、標的遺伝子のみを組み込んだ導入遺伝子を、作成した。