発癌ストレスによるp16^<INK4a>遺伝子の発現調節と皮膚癌発症機構との関連

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16390318
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 大谷 直子 徳島大学, ゲノム機能研究センター, 助教授 (50275195)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 英二 徳島大学, ゲノム機能研究センター, 教授 (80263268) ; 久保 宜明 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 講師 (10260069)
• Keywords: p16^<INK4a>遺伝子 / 可視化 / BAC / 皮膚癌

Research Abstract

p16^<INK4a>遺伝子が存在するINK4a/ARF locusを含むヒトゲノミックDNA(約100kb)が組み込まれた149I2-BACクローンを用い、エキソン、イントロン構造を保ったままp16^<INK4a>の発現を可視化するため、p16^<INK4a>遺伝子のコーディング領域の3'端にルシフェラーゼ遺伝子cDNAをインフレームで挿入し、p16^<INK4a>とルシフェラーゼの融合蛋白を発現するBACベクターを構築した。その際、制限酵素部位を利用してBACクローン上でfusion蛋白を構築することは困難なため、recombinaseを用いて大腸菌内でのhomologous recombinationを利用して作成した。このBACベクターをp16^<INK4a>BAC-lucと名付けた。
このp16^<INK4a>BAC-lucよりp16^<INK4a>とルシフェラーゼの融合蛋白が発現しているかどうかを確認するため、様々な培養細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼアッセイを行ったところ高いルシフェラーゼ活性が得られ、またウエスタンブロッティングにても融合蛋白の発現が認められた。
現在、皮膚癌細胞を使ってp16^<INK4a>BAC-lucを発現するStable Cell Lineを作成している。また、p16^<INK4a>BAC-lucを発現するトランスジェニックマウスの作成に取り組んでいる。p16^<INK4a>BAC-lucを発現するStable Cell Lineおよびトランスジェニックマウスが得られれば、様々な皮膚癌を誘発するような刺激やストレスを加えて、皮膚癌発症とp16^<INK4a>遺伝子との関連についてin vitroおよびin vivoにて、詳しく検討する予定である。