2004 Fiscal Year Annual Research Report
結膜上皮層内に存在する角膜上皮細胞クラスターの同定とその臨床応用
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16390502
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
木下 茂 京都府立医科大学, 医学研究科, 教授 (30116024)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 諭 京都府立医科大学, 医学研究科, 助手 (60347458)
稲冨 勉 京都府立医科大学, 医学研究科, 助手 (00305583)
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| Keywords | cytokeratin 12 / corneal epithelium / conjunctival epithelium / amniotic membrane / immunostaining / western blotting / flowcytometry / in situ hybridization |
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| Research Abstract |
結膜上皮に存在するケラチン12陽性細胞の分布を免疫染色にて検討した。結膜上皮にはクラスター状あるいは散在性にケラチン12陽性細胞が存在していた。ケラチン4あるいはケラチン13の発現との関連を調べたところ、ケラチン12とは相互排他的な分布を示した。また免疫染色の特異性を検討するため、別のケラチン12抗体で染色したところ両者の分布は完全に一致した。またin situ hybridizationにてケラチン12mRNAの分布を調べたところ、免疫染色の結果とmRNAの分布はほぼ一致した。さらにWestern blottingを行い、結膜上皮細胞にケラチン12が存在することを認めた。またフローサイトメトリーを行ったところ、結膜上皮のケラチン12陽性細胞は結膜上皮全体の1〜3%であることがわかった。
次に結膜上皮を羊膜上に培養して上皮シートとして角膜上に移植することを試みた。まず結膜組織を酵素処理して上皮細胞だけを選別して羊膜上に培養した。コンフルエントとなった後にカルシウムスイッチとエアリフティングによって分化と重層化を促したところ、6-10層の重層上皮となった。これをウサギの角膜上に移植したところ移植後5日目には上皮被覆面積は倍の大きさとなった。移植後2週間日の組織を検討したところ、角膜上の上皮は輪部より中央部にかけてあまねく重層化しており、ヒトの角膜上皮の構造に非常に類似していた。また角膜上を覆う上皮細胞が移植したものかどうかを免疫染色にて検討したところ、角膜上の上皮細胞は全て移植した上皮であることが判明した。ムチンの発現を調べたところ、Muc4は培養段階では発現していなかったが、移植後の上皮には発現していた。Muc5ACは培養段階でも移植後にも発現が見られなかった。ケラチン4は培養段階でも移植後にも認められ、移植後2週間目という時期には分化転換が起こっていないことを示唆した。
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