2004 Fiscal Year Annual Research Report
神経幹細胞の栄養因子による神経分化誘導と分化機構の解明による障害脳機能の再建
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16500203
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
飛田 秀樹 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (00305525)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西野 仁雄 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60073730)
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| Keywords | 神経幹細胞 / 低酸素条件 / 細胞培養濃度 / ドパミンニューロン / IL-1b / Wnt 5a |
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| Research Abstract |
胚性幹(ES)細胞由来の神経幹細胞からドパミン(DA)ニューロンへより効率的な分化誘導条件を調べるため、まず、A)ES)細胞からDAニューロンへの5段階分化誘導培養法の厳密な培養条件を、免疫染色法およびPCRを用いて再検証した。その後、B)EBs細胞形成期(stage2)の培養細胞濃度および低酸素(3.5%)条件の検討、C)nestin陽性神経幹細胞の増殖段階(stage4)の低酸素条件および分化因子処置の検討、等を行った。その結果stage2における検討から、1)1×10^4/cm^2の細胞密度での培養が神経系およびDA分化効率が最も良いこと、2)低酸素条件では分裂能の低下のため比較的均一な小EBs塊が形成されること、3)stage2以降の低酸素条件培養によりDA分化効率が低下することが明らかになった。またstage4の検討から、4)低酸素条件ではより小さなneurosphereが形成されること、5)DA分化効率が促進されること、さらに6)DA欠如線条体で発現増加しているIL1βの処置によりDA分化が促進されること、また7)DA欠如線条体で発現が一定であるIL1αの処置ではDA分化促進は認められないこと、等が明らかになった。上記の結果は、主にチロシン水酸化酵素(TH)等の免疫染色による細胞カウントによるデータである。しかしwestern blot法ではTH蛋白の発現量は検出レベル以下であるので、ES細胞からDAニューロンへの効率の良い分化誘導と成熟したDA分化には、更なる工夫が必要であると考えられる。
一方、中脳DAニューロンの発生に関与するWnt5a遺伝子のクローニングを行い、Cre-loxP系ベクターおよび強制発現系ベクターを作成した。現在stage4におけるWnt5aの作用解析を進めている。
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