細胞膜マイクロドメイン情報伝達機構の定量プロテオミクス及びリピドミクスによる解明

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16570100
• Research Institution: JUNTENDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 柳田 光昭 順天堂大学, 医学部, 講師 (80365569)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加賀 直子 順天堂大学, 医学部, 助手 (80338342) ; 岩渕 和久 順天堂大学, 医療看護学部, 助教授 (10184897)
• Keywords: 定量プロテオミクス / リピドミクス / マイクロドメイン / 質量分析 / 安定同位体標識

Research Abstract

前骨髄性白血病細胞株HL-60の細胞膜から、DMSOによる好中球系細胞への分化誘導前後において、ラクトシルセラミドに富む細胞膜マイクロドメインとして1%TritonX-100不溶性膜画分(DRM)をショ糖密度勾配遠心で調製した。マイクロドメインからタンパク質を抽出し、トリプシン消化により断片化したペプチド混合物をナノ流速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析(LC-MS/MS)し、データベースサーチにより網羅的に構成タンパク質を同定した。その結果、約120種類のタンパク質を同定し、その中にはマイクロドメインに存在することが知られているflotillin1, flotillin2などの他、細胞表面CD抗原、Gタンパク質などが存在した。これらのうち、分化誘導前後で発現が異なるタンパク質をそれぞれ41種類、25種類検出した。
分化前後で発現が異なるタンパク質分子の中から12種類のタンパク質を選び、それぞれについて存在量を質量分析法で定量するために、対照ペプチドとして安定同位体^<13>C,^<15>N-リジンあるいは^<13>C,^<15>N-ロイシンで標識した合成ペプチドを作成した。合成された安定同位体標識ペプチドは天然の分子に比べて^<13>Cと^<15>Nの個数の分だけ質量数が大きい分子量を持つことを確認した。この合成ペプチドを内部標準ペプチドとして一定量ずつ試料に混合してLC-MS/MSを行い、マスクロマトグラムでの強度比から各タンパク質の存在量を定量比較した。その結果、DMSO分化によりtransferrin receptorなどのタンパク質の存在量が減少すること、flotillin1,2などのタンパク質の量が増加することを確認した。
本研究の成果は第28回日本分子生物学会年会(福岡)にて発表した。