2005 Fiscal Year Annual Research Report
精子ベクターによるゼブラフィッシュRNA interference個体の作出
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16570179
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
酒井 則良 国立遺伝学研究所, 系統生物研究センター, 助教授 (50202081)
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / 培養精子 / RNAi / リバースジェネティクス / 細胞培養 |
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| Research Abstract |
ゼブラフィッシュは、フォワードジェネティクスの優れた研究材料であるものの、有効なリバースジェネティクス法がないことが大きな欠点であり、個々の遺伝子の詳細な機能解析を困難にしている。本研究では、ゼブラフィッシュにおけるRNA干渉の有効性を調べ、培養精子を用いてshort hairpin RNA(shRNA)コードDNAを導入した遺伝子発現抑制型ゼブラフィッシュを作出することを目的として以下の解析を進めた。突然変異体の表現型がわかっていて抗体も作られている遺伝子としてshhを、抑制効果の見やすい遺伝子としてgfpを対象とした。
RNA干渉による発現抑制効果はその配列に依存するため、small interference RNA(siRNA)を1細胞胚へマイクロインジェクションし、その表現型とmRNA量を調べた。4種の配列うち1つがshh変異体と類似の表現型を示し、そのmRNA量も減少していた。gfp-siRNAでもmRNA量の減少が認められ、ゼブラフィッシュにおいてもRNA干渉が有効であることが示唆された。そこで、効果的に抑制効果を持つ配列を見つけられる系が必要と考え、細胞培養系による解析法の確立をおこなった。発達段階の異なる初期胚から容易に培養細胞を樹立できる培養条件と、さらに、その細胞へ30〜40%遺伝子導入できるエレクトロポレーションの条件を確立した。中期胞胚から樹立した培養細胞ではstat3やfoo等の遺伝子も発現していることが確認でき、様々な発達段階の胚から培養細胞を樹立することにより、多くの遺伝子に対しての抑制配列を効率良く調べることが可能であると考えられる。現在、上記の抑制配列のshRNAを転写するレトロウイルスベクターの作出を終え、培養精子に感染させて目的の遺伝子発現抑制型ゼブラフィッシュを作出中である。
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