2004 Fiscal Year Annual Research Report
ヒラメ自然免疫関連サイトカイン遺伝子の発現調節機構に関する研究
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16580147
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
廣野 育生 東京海洋大学, 大学院・海洋科学技術研究科, 助教授 (00270926)
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| Keywords | ヒラメ / サイトカイン / 遺伝子プロモーター / 腫瘍壊死因子 / ゼブラフィッシュ / LPS |
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| Research Abstract |
ヒラメよりクローン化した腫瘍壊死因子TNF-αのプロモーター領域をレポーター緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)ならびに細菌由来のクロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)遺伝子の上流に連結した組換えプラスミドDNAを構築した。これら組換えプラスミドDNAをヒラメの腎臓および胚より樹立された株化細胞YO-KとHINAEへ導入した。組換えプラスミドDNAを取り込んだ細胞の選別はプラスミドにコードされているネオマイシンにより行った。次いで、細胞培養液中に細菌内毒素であるリポ多糖を添加し、経時的にレポーター遺伝子の発現変化を測定したところ、遺伝子発現が誘導されることが分かった。また、リポ多糖の添加する量に依存してレポーター遺伝子の発現量も変化した。さらに、プロモーター領域のデレーションミュータントを作製し、プロモーター活性を測定したところ、内部に存在するNf-KB結合領域がLPS応答に重要であることがわかった。
ゼブラフィッシュ胚への組換えプラスミドDNAの導入はマイクロインジェクション法により行った。組換えプラスミドDNA導入個体の選別は、鰭の一部よりDNAを抽出し、レポーター遺伝子を標的としたPCR法により行った。PCRで陽性になった個体を飼育し、F2世代を作出した。今後、このF2世代のトランスジェニツクゼブラフィッシュを用いて腫瘍壊死因子TNF-αのプロモーターの働きを詳細に解析する。
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