2004 Fiscal Year Annual Research Report
概日リズムホルモン・メラトニンの合成酵素のレドックス制御
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16590049
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| Research Institution | Shujitsu University |
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Principal Investigator |
坪井 誠二 就実大学, 薬学部, 教授 (50172052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八代 聖基 就実大学, 薬学部, 助手
森山 芳則 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (10150658)
大塚 正人 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 助手 (30243489)
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| Keywords | メラトニン / メラトニン合成酵素 / レドックス制御 / 概日リズム / ジスルフィド結合 |
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| Research Abstract |
メラトニン合成酵素のレドックス制御について以下の結果を得た。
(1)活性に必要なシステイン残基の同定
NATには種間に保存されている5つのシステイン残基(37,61,75,158,177番目)が存在する。Acetyl CoAの前処理によりNEMによる活性阻害が抑制されることから,^<14>C-NEMを用いてAcetyl CoA存在下,及び非存在下における^<14>C-NEMの取り込みを比較した結果,61及び177番目のシステインが活性に重要であることを見出した。このことはC61A(61番目のシステインをアラニンに変えたもの)及びC177A(177番目のシステインをアラニンに変えたもの),またC61A/C177A(61番目及び177番目のシステインをアラニンに変えたもの)のdouble mutantがNEMの処理により失活しなかったことからも示唆された。
3.分子内ジスルフィド結合の同定
分子内-S-S-結合の同定を行った。まず,NATをAcetyl CoAで処理することによりCys61及びCysl77を保護し,活性に関係のないシステインをNEMで修飾した。その後DTT存在下または非存在下5時間透析を行い,各々還元型または酸化型を調製した。V_8 protease消化後,それぞれ酸化型または還元型だけに見られるフラグメントをHPLCにより単離・精製した。酸化型から得られたフラグメントをDTTにより還元処理すると2本のフラグメントが得られ,各々還元型から得られたフラグメントと一致した。この2本のフラグメントのアミノ酸配列を調べた結果,Cys61及びCys177が含まれていた。
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