2004 Fiscal Year Annual Research Report
概日振動を示す遺伝子群の多角的・効率的機能スクリーニングによる体内時計機構の解明
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16590184
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
早坂 直人 近畿大学, 医学部, 助手 (80368290)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
重吉 康史 近畿大学, 医学部, 教授 (20275192)
長野 護 近畿大学, 医学部, 助手 (80155960)
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| Keywords | 視交叉上核 / 概日リズム / Rgs16 / レンチウイルス / Hmg4 / RNAi / スライスカルチャー / 肝臓 |
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| Research Abstract |
以前我々が報告した、視交叉上核や肝臓で発現に概日リズムを示す遺伝子群の中で、特に発現様式が特徴的であったRgs16とHmg4の両遺伝子を手始めに選択し、組織培養、あるいは個体レベルで迅速に機能を解析する方法の確立を目指した。まず、組織や細胞、個体に効率良く遺伝子を導入し、強制発現、あるいは発現抑制させることによってそれぞれの遺伝子の機能を解析する方法を検討した。遺伝子導入には、広範な細胞に効率よく感染するレンチウイルスを用い、Rgs16とHmg4それぞれの強制発現、あるいはRNAiによって発現抑制させるウイルスを作製し、脳のスライスや肝臓等の培養組織に感染させた。また、in vivoでの感染法として、尾静脈からウイルスを注入して肝臓に感染させる方法や、視交叉上核に直接ウイルスを注入する方法の至適化を行った。これまでに、個体に上記の方法でウイルスを感染させる方法が多数の細胞に効率よく感染させられることを見出し、Rgs16,Hmg4の過剰発現ウイルスの感染に成功した。更に各組織の全細胞で目的の遺伝子を発現させるため、レンチウイルスを卵に感染させてトランスジェニックラットを作製することを試みており、既にGFPを発現するウイルスの感染で、高率にトランスジェニック個体を得ることに成功している。今後はこれらの方法で作製した個体、培養組織、細胞を用いて、各遺伝子の概日時計への関与を検討していく。
一方、概日リズムへの影響を解析する上で、発現に概日振動を示す遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼを連結したリポーター遺伝子を細胞、組織あるいは個体で発現させることは、機能スクリーニングの上で非常に有用である。そこで、Per2::lucを発現するトランスジェニックラット由来の細胞を単離し、上記のウイルスを感染させたり、組織培養で同様に感染実験をする、更にはPer::lucラットにウイルスを感染させてリズムへの影響を見る、といった実験を開始している。たとえば個体で行動リズムや遺伝子発現のリズムにどのような影響があるかを検討中である。
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