新奇GTミスマッチDNA結合タンパク質の解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16590248
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 中村 三千男 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (30091276)
• Keywords: GTミスマッチ / DNA修復

Research Abstract

厳密なTRTRNB(RはTと塩基対をなすhypoxanthineかG)配列に結合する新奇なG/TミスマッチDNA結合タンパク質(nGTBP)を大量の核抽出液から精製し、その構造と遺伝子を確定し、リコンビナントタンパク質(rnGTBP)で生化学的機能を解析することくを目指し、以下の結果を得た。
1.nGTBPの精製をさらに進める:大量に準備した核抽出液からnGTBPをゲル濾過/ヘパリンカラム/アフィニティカラムで高度精製し、部分アミノ酸配列を決定することを目指した。nGTBPはヘパリンカラム、アフィニティーカラムに吸着はするものの、多様な溶出条件でも(3M KClを含む!)、再現性よく活性を持った状態では回収できなかった。また、アフィニティーゲルのSDS溶出後のタンパク染色でバンドの特定を試みたが、ミスマッチDNAゲルとマッチDNAゲルの間に再現性のある相違を認める事ができなかった。しかし、核抽出液のSDS-PAGE-トランスブロット-サウスウエスタンを行って特定バンドの検出に成功した。その後、ミスマッチDNAゲル通過画分からサウスウエスタンで特異的に検出できなくなるバンドが2本再現性よく同定できた。この事から、nGTBPは以下の2つの可能性が考えられた。(1)単一ペプチドでミスマッチDNAから外れると失活する。(2)同サイズのヘテロマーで、DNA結合サブユニットと非結合サブユニットを含み、新たな結合はヘテロマーが必須。目下クローニングと精製の両方から解析を続けている。
2.nGTBPの生化学的解析 3.アミノ酸配列決定 4.リコンビナントタンパク質を用いたに機能解析 5.nGTBPのin vivo機能解析の項目については、進展を見なかった。ただし、上記進展にもとづいて、3-5の項目は達成できるであろう。その成果の一部は平成18年度の日本熱帯医学会発表する予定である。