細菌性コラゲナーゼによる宿主細胞外マトリックスの分子認識にかかる学際的研究

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16590363
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 松下 治 国立大学法人香川大学, 医学部, 助教授 (00209537)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小出 隆規 国立大学法人香川大学, 医学部, 助教授 (70322253)
• Keywords: 細菌性コラゲナーゼ / コラーゲン結合ドメイン / NMR解析 / 基質認識

Research Abstract

1.コラーゲン結合ドメイン(CBD)の構造活性相関に関する検討
Clostridium histolyticumクラスIコラゲナーゼのCBDの立体構造を決定したところ、βサンドイッチ側面に新様式のCa^<2+>結合部位が見いだされた。X線結晶学的解析により、Ca^<2+>結合に伴ってCBDのN末側リンカーがαヘリックスからβストランドへコンフォメーションを変えることが示された。この変化が水溶液中の構造変化を反映している事を示すため、CBDを^<13>C,^<15>N標識し、種々の濃度のCa^<2+>存在下でNMR解析を行ったところ、結晶中と同様の変化が水溶液中で観察された。
また9菌種のClostridium属細菌のコラゲナーゼ遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列を用いてデータベースから相同なCBD遺伝子を網羅的に検出し、それらの配列を比較したところ、ほぼすべてのCBDにおいてCa^<2+>結合モチーフが保存されていた。また類縁のM9Aファミリーに属するコラゲナーゼのC末端に存在するPPCドメインにはこのモチーフは全く見いだされなかった。
以上より、CBDのCa^<2+>結合部位は、本ドメインの構造変化と機能発現を特徴づけるものであると示唆された。
2.CBDの基質認識スペクトルの検討
(Pro-Pro-Gly)_nおよび(Pro-Pro-Gly)_nを固相化したセファロース・ビーズを用いてCBDの基質結合を調べたところ、nが十分に大きい時にのみCBDは結合性を示すことが示された。これらのペプチドはnが十分に大きい時に三重らせん構造を取り、CBDはこの構造を認識したためと考えられる。そこでnが小さく通常は結合性を示さないペプチドを用いて二つの異なる条件により三重らせん構造を形成させたところ、CBDは結合性を示すようになった。CBDは確かにコンフォメーション特異的に基質を認識していると考えられる。