Notchレセプター糖鎖転移酵素フリンジのTリンパ球特異的ジーン・ターゲティング

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16590407
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 岸原 健二 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教授 (80214774)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前川 洋一 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (10294670) ; 九十九 伸一 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (10346596)
• Keywords: ジーン・ターゲティング / Tリンパ球 / 糖鎖転移酵素 / 細胞分化 / Notch / 細胞系譜決定

Research Abstract

[1]ターゲティング・ベクターの構築
Notchレセプターに対する糖鎖転移酵素であるフリンジ(lunatic fringe)の完全欠損マウスは胎生致死になることから、フリンジのTリンパ球特異的なジーン・ターゲティングを行うためのベクターの構築を行った。まず、ゲノムDNAライブラリーからフリンジのゲノム遺伝子をクローニングした。そのゲノムDNA断片を基にして、約3kbの短腕部と約6kbの長腕部から構成されるターゲティング・ベクターを完成した。loxP配列を両端にもつネオマシン耐性遺伝子発現カセット(NEOR)はエクソン1の約3kb上流のBamHI部位に挿入し、エクソン1を除去するために必要なさらなるloxP配列をエクソン1の下流近傍に存在するHindIII部位にNEORと同じ方向になるように挿入した。さらに、相同組換えの頻度を向上する目的で、長腕の末端にHSV由来のthymidine kinase遺伝子発現カセットを挿入した。
[2]変異導入胚幹細胞株の樹立
このターゲティング・ベクターDNAは、胚幹細胞(ES細胞)にエレクトロポレーションにて導入され、その後、ES細胞はG418およびgancyclovir存在下で選択培養された。培養7〜10日目で出現してきたES細胞のコロニーを採取し、その一部はPCRによる相同組換えの検査に、残りを継代培養した。現在まで約1,000コロニーに1個の頻度で目的の変異をもつクローン3個得られたが、形態上分化が進行していることから、新しいクローンの獲得するために繰返しスクリーニングを実施している。また、相同組換え頻度が低いことから、新しいターゲティングベクターの構築も検討している。