2005 Fiscal Year Annual Research Report
ELISPOTアッセイによる母児免疫寛容検出法の確立と臨床応用に関する研究
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16590954
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
島崎 千尋 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50170931)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤塚 美樹 愛知県がんセンター研究所, 腫瘍免疫学部, 室長 (70333391)
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| Keywords | 母児免疫寛容 / 母児間マイクロキメリズム / ELISPOTアッセィ / 母児間移植 / 同種造血幹細胞移植 |
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| Research Abstract |
1.プラスミドのトランスフォーメーションと増幅
HLA-A11、A0201、A2401、A33-DNA導入プラスミドをコンピテントセルへ導入し、寒天培地で培養後コロニーを採取、LB培地へ移した。培養後増幅した大腸菌よりプラスミドを回収純化した。それぞれのプラスミドの100倍近い増幅に成功し、十分量のプラスミドを得た。
2.プラスミドからHLA-mRNAの作成
HLA-DNA導入プラスミドを制限酵素で切断後、キットを用いてテンプレートDNAの精製とRNAの合成を行った。得られたRNAは電気泳動によって分子量を検定し、さらに純化精製した。HLA-DNAを導入したプラスミドから約1000kbの目的HLA-mRNAを得ることができた。
3.CD40L-NIH3T3によるB細胞の増幅と純化
末梢血液より単核球を分離し、IMDMに浮遊後、IL-4の存在下に放射線照射により不活性化したCD40L-NIH3T3であるfeeder cellと共培養した。約10日間の培養後MACS法による純化を行い、10mlの末梢血液から1.0x10^7程度の活性化B細胞を得ることができた。
4.Electroporation法によるmRNAのB細胞への導入
得られたHLA-mRNAを電気穿孔法を用いて活性化B細胞へ導入した。その後、再度CD40L-NIH3T3とIL-4により刺激した。電気穿孔後のViabilityは75%以上を維持していた。
5.ELISPOT法によるINF-γ産生細胞の同定
末梢血液より単核球を分離し、MACS法でCD8陽性T細胞を純化した。純度は95%以上であった。作成したHLA-mRNA導入B細胞をStimulator、CD8陽性細胞をResponderとし様々な割合で混合して4時間培養後、ELISPOT法によりINF-γ産生細胞の同定を行った。
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