2004 Fiscal Year Annual Research Report
結合組織成長因子(CTGF)の制御による臓器線維症治療のための基礎的研究
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16591000
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
吉田 浩二 近畿大学, 医学部, 講師 (60230736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斉藤 昭夫 近畿大学, 医学部, 講師 (40153788)
早川 清雄 近畿大学, 医学部, 助手 (00368292)
仲谷 達也 近畿大学, 医学部, 講師 (40319661)
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| Keywords | CTGF / beta2-glycoprotein I / transferrin / two-hybrid |
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| Research Abstract |
1.CTGF cDNAのクローニング
すでに報告されているCTGF mRNA塩基配列を参考にして、PCRによるクローニングのためのprimerを設計し、ヒト肝臓cDNAライブラリー(市販品)からCTGF cDNAをクローニングした。DNAシークエンスにより、このcDNAがCTGFであることを確認して以下の実験に進んだ。
2.酵母two-hybrid法によるCTGFと結合するタンパク質のスクリーニング
酵母two-hybrid法はタンパク質間相互作用を酵母細胞内で検出する実験系である。
(1)上記のようにクローニングしたヒトCTGFの全長をbaitとした。これとreporter plasmidで酵母EGY48を形質転換し、さらにprey vectorに組み込んだヒト肝臓cDNAライブラリーで形質転換した(一次スクリーニング)。ここで得たクローンをβ-ガラクトシダーゼ活性とロイシン要求性を併用して二次スクリーニングを行い、両方のアッセイで陽性になったもののみを最終的な陽性クローンとした。
(2)約2.1×10^6個の形質転換体をスクリーニングしたところ、preyタンパク質としてbeta2-glycoprotein I(B2GPI)とtransferrin(Tf)が同定された。B2GPIの生理的機能は現在不明であるが、血液凝固に関与し抗リン脂質抗体症候群の診断に用いられている。Tfは鉄の輸送タンパク質であるがinsulinlike growth factorと結合し細胞増殖の制御にも関係することが報告されている。B2GPIとTfはいずれも線維化との関連性は知られておらず本研究での新知見である。
(3)上記のpreyタンパク質以外にもCTGFと結合するタンパク質が存在する可能性があるため、ライブラリーの種類を代えて(肺線維芽細胞cDNAライブラリー)さらにスクリーニングを進めているところである。
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