2004 Fiscal Year Annual Research Report
腎糸球体上皮細胞に関連する新規蛋白の同定と機能解析
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16591012
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
小林 武弘 新潟大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (90311670)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池住 洋平 新潟大学, 医歯学総合病院, 助手 (70361897)
金子 詩子 新潟大学, 医歯学総合病院, 医員
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| Keywords | 腎臓 / ポドシン / 結合蛋白 |
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| Research Abstract |
Yeast-two-hybrid systemを用いて、マウス腎臓由来cDNAライブラリーをスクリーニングしポドシンと結合すると思われるcDNA断片を得、DNAオートシークエンサーで塩基配列を決定した。このcDNAの塩基配列を基に、マウス腎臓由来cDNAを用いてPCR(Polymerase Chain Reaction)-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法を行った。5'方向、3'方向にPCR-RACE法を繰り返し、全コード領域を単離した。コード領域は1659塩基より成り、552アミノ酸をコードすると考えられた。このcDNAをプローブとし、種々の臓器由来のmRNAを用いたノーザンブロット解析では、主に腎臓に発現しており、他の臓器ではほとんど発現を認めなかった。遺伝子バンクを通じた検索では、既知の蛋白質とは一致しなかった。明らかな機能モチーフは認めなかったが、ラットの膜トランスポーター蛋白に軽度のホモロジーがあった。得られたcDNAをGST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)との融合蛋白となるように大腸菌発現ベクターに組み込んだ。このプラスミドを大腸菌に導入し発現を誘導した。抗GST抗体を用いたウエスタンブロット解析では組み換え蛋白は不溶画分に認め、可溶画分には認めなかった。グルタチオンビーズを用いて大腸菌の細胞抽出液から組み換え蛋白の精製を試みたが、クマシー染色ではバンドを確認できず、ウエスタンブロットでごく淡いバンドを認めた。
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