無細胞蛋白発現系を用いたプロテオミクス時代の膠細胞腫瘍免疫治療法の開発

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591437
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 齊尾 征直 岐阜大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (40242721)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高見 剛 岐阜大学, 大学院・医学研究科, 教授 (70136943) ; 大江 直行 岐阜大学, 大学院・医学研究科, 助手 (60362159)
• Keywords: IL-2 / IL-15 / TNFRスーパーファミリー / 腫瘍内浸潤リンパ球 / 無細胞蛋白発現 / マウス

Research Abstract

本年度は,交付申請書提出時の内容に則し以下のことを検討した。
1)インターロイキン(IL)2及びIL-15の遺伝子の無細胞蛋白発現用ベクターへの組換えと蛋白の産生及び質の評価:
IL-2,IL-15いずれも無細胞蛋白発現系において,高率に反応液の上清分画に組み換え蛋白が回収でき,蛋白C末にヒスチジンタグを付けることで,ニッケルカラムによる高純度な蛋白の精製に成功した。収量はIL-2において現時点で,120ugを1mlの反応系から精製できることが分かった。一方,無細胞蛋白発現系では糖鎖の修飾が起こらないが,脾細胞を用いた自作IL-2のin vitroでの投与により,脾細胞の活性化が得られ,自作蛋白が生物活性を持つことが判明した。来年度は,小動物用小型浸透圧ポンプを用いて持続的なインターロイキンの投与系を確立する。一方で,TNFRスーパーファミリーでは,sTNFRII,sFasの遺伝子のGL261への遺伝子組換えとクローンの作成が終了しているので,TNFαやFasリガンドのT細胞活性化や細胞死誘導への関与の解析に役立てる。
2)GL-261の皮下及び脳内への接種系の確立と腫瘍内浸潤Tリンパ球の解析:
GL261の脳内及び皮下への接種で,脳内では1×10^5個,皮下では1×10^6個で腫瘍の生着が全例でみられた。また,腫瘍内浸潤リンパ球(接種後12日目)を磁気ビーズ法で精製し表面マーカーを解析した。いずれもCD8^+Tリンパ球で活性化抗原のCD25の陽性率は5%以下であり,他の腫瘍(MCA38やB16)の場合と同様であった。また,回収細胞数は,GL261がMHCクラスI陰性であるにも拘らず腫瘍重量1g当たり約5×10^5個程度を回収できることが判明した。
よって,次年度は,さらなるリンパ球の解析をサイトカインや可溶型TNFRスーパーファミリーの有無で検討し,論文執筆と最終年度の報告書作成を行う。