HVJenvelopeベクターによりBMP2遺伝子導入した間葉系細胞の骨再生

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591471
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 菊地 憲明 山形大学, 医学部, 助手 (90361261)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土田 浩之 山形大学, 医学部, 助教授 (40250922) ; 橋本 淳一 山形大学, 医学部, 助手 (10359565) ; 川前 金幸 山形大学, 医学部, 教授 (70254026)
• Keywords: 骨形成 / 遺伝子治療 / 間葉系幹細胞 / BMP / ラット / HVJ enevelope ベクター

Research Abstract

HVJ envelope法により、BMP遺伝子を導入した幹細胞の骨形成能と移植幹細胞の拒絶について明らかにすることが目的とした。HVJ envelope法は、ウィルス遺伝子を不活化し、無毒化する技術であり、細胞膜の融合能のみを残すことで、ウィルス毒生のない遺伝子導入が可能である。実験群としてLewis雄ラットをdonorとして用い、recipientはBrown Norway雌ラット(同種異系)と、Lewis雌ラット(同種同系)を用いる。
Lewis雄ラットの大腿骨からflash out法により採取し、第2継代まで培養した間葉系幹細胞をコラーゲンで3次元培養する。Recipientラットにプレート、釘固定し、6mmの大腿骨骨欠損部を作成し移植する。移植する細胞にはBMP遺伝子導入する群とコントロール群とを制作する。骨評価を軟X線撮像で評価し、また同時期に組織学的に評価する。雄の幹細胞を雌に移植するため、雄にのみ存在するY染色体を検出するためにfluorescence in situ hubridizationを行い、移植細胞の生存期間、部位を評価する。
コントロールとしてアデノウイルス(AD5)をベクターに用いたBMP遺伝子導入では、骨形成が観察され、骨欠損部に細胞とともに移植を行なうことで骨癒合が得られた。
理化学研究所より得たBNP4のプラスミド(50μl)をHVJ:5AUに封入しBrown Norwayラットの大腿部に筋肉内注射した群では、移植後2週、4週でもレントゲンで骨陰影観察されなかった。さらにHVJ:10AUで封入しても骨陰影は観察されなかった。導入効率がアデノウイルスほど高くないためと考え、プラスミド単独では骨形成は困難と判断した。現在、間葉系幹細胞と合わせることで、BNP-4 cDNA50μlをHVJ:10AUで封入し、Brown Norwayラットに骨形成を得るべく移植実験中である。