2004 Fiscal Year Annual Research Report
婦人科悪性腫瘍が産生するカリクレイン属セリンプロテアーゼに関する研究
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16591678
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
宮城 悦子 横浜市立大学, 医学部, 講師 (40275053)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平原 史樹 横浜市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (30201734)
宮城 洋平 神奈川県立がんセンター, 臨床研究所・腫瘍病理研究室, 技官 (00254194)
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| Keywords | 卵巣癌 / 浸潤・転移 / セリンプロテアーゼ / カリクレイン / 臨床検体 / 遺伝子発現 |
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| Research Abstract |
ヒトカリクレイン(Human KLK)4,5,6,9,10,11について,臨床検体間における遺伝子発現量比較のためにABI PRISM 7700 Sequence Detector(ABI)を利用したTaqMan Probe Real-time RT-PCR法を行う準備を進めた.
まず,Primer Express ver 1.5(ABI)ソフトウェアを用いてHuman KLK 4,5,6,9,10,11のopen reading frame内においてReal-time RT-PCR用プライマーおよびTaqMan Probeをデザインした.これらのプライマーを用い,卵巣癌細胞株3種(OVISE, OVTOKO, MCAS)から得られたcDNAを鋳型として通常のPCRを行った後,PCR産物をサブクローニング,塩基配列を解析したところ,デザインした全てのプライマーが標的cDNAを特異的に増幅することが確認された.
さらに上記の過程で得られたPCR産物をサブクローニングしたベクタープラスミドを標準コントロール検体に利用して,標準曲線法でReal-time PCRを行うこととした.内因コントロールには18sを標的遺伝子とし,ABI社から提供されているTaqMan Real-time PCR TaqMan Ribosomal RNA Control Reagentsを使用した.
提供者の同意の下,手術検体より得られた卵巣癌組織34検体は,近接組織HE標本を顕微鏡下に観察し,癌組織が組織の大半を占めていることを確認した.各々の組織よりQIAGEN Rneasy KiRNA抽出し,oligo-dT primerを用いてcomplementary DNAを作製,β-actin発現を通常PCRで確認し,RNAの変性が最小限であることを確認した.現在,Real-time PCR法にて各サブタイプの遺伝子発現量の定量を進めている.
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