2005 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳類初期発生における遺伝子リプログラミングとクロマチンとエピジェネティクス
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16591684
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
田中 守 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (20207145)
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| Keywords | リンカーヒストン / 卵子 / H1foo |
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| Research Abstract |
本研究では、卵子の成熟化機構におけるH1oo蛋白の役割を明らかにするために、H1ooとCSF (Cytostatic factor), MPF (Maturation promoting factor)との関連について検討を加えた。大腸菌発現ベクターにH1ooの翻訳領域をクローニングし、リコンビナント蛋白を作成する。作成されたH1oo蛋白は、C末端に追加されたヒスチジンのエピトープにより、ニッケルレジンカラムで精製し実験に使用した。リコンビナントH1ooを受精前後の卵子抽出物やMPF (Maturation Promoting Factor)の活性中心であるリコンビナントcdc2/cyclinBと放射性同位元素によってラベルしたATPと反応させることによって、H1ooが実際にリン酸化されるかどうか検討する。また、過排卵により回収されたマウス卵子及びマウス初期胚を使用し、抽出蛋白を抗H1oo抗体で免疫沈降することによって卵子成熟・初期発生の各時期でのH1oo蛋白を回収する。回収したH1oo蛋白をpolyacrylamideゲルにて泳動し、セルロース膜にブロッティングした後、抗H1oo蛋白抗体でのリン酸化の卵子成熟・初期発生における変化を検討した。その結果、卵子抽出物やリコンビナントcdc2/cyclinBによってH1fooがリン酸化されることが明らかとなった。また、GFP-H1oo,GFP-H1c恒常発現3T3細胞を作成し、核蛋白抽出キット(Pierce)を使用して、核蛋白を抽出し、抗体アレイを使用し、核蛋白をアレイに結合させ、さらに抗GFP抗体でアレイ上に残った蛋白と結合しているGFP-H1oo,GFP-H1c蛋白を検出した。実際に細胞周期関連蛋白や細胞死関連蛋白がH1fooと蛋白相互作用を有することが明らかとなり、H1fooが細胞周期における重要なレギュレーターであることが示唆された。
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