新しい角膜拒絶反応抑制法の開発〜ナチュラルキラーT細胞を利用して〜

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591757
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 園田 康平 九州大学, 大学院・医学研究院, 助手 (10294943)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 裕樹 佐賀大学, 医学部・分子生命科学講座, 教授 (40260715) ; 江頭 健輔 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (60260379) ; 畑 快右 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (90346776) ; 吉田 茂生 九州大学, 大学病院, 助手 (50363370)
• Keywords: 角膜移植 / NKT細胞 / サイトカイン / トレランス / DNAマイクロアレー / 遺伝子導入 / 免疫療法

Research Abstract

マウス角膜移植モデルでのNKT細胞の解析
ドナーとしてC57BL/6マウス、レシピエントとしてBALB/cマウスを用いる。ドナー角膜から2ミリ径角膜片を切り出し、同等の大きさにくりぬいたレシピエント角膜に11-0ナイロン針で8針端々縫合する。角膜移植後レシピエントマウスにおいて、経時的に(脾臓)NKT細胞のサイトカイン・ケモカイン産生と表面発現分子をフローサイトメトリー(細胞内・細胞外)で解析した。移植後7日目からNKT細胞はIL-10サイトカインを発現した。
レシピエントマウス由来NKT細胞の分離・培養
移植後NKT細胞を脾臓および末梢血から分離し、その産生するサイトカイン・ケモカインを解析する。マウスNKT細胞は抗NK1.1抗体を用いた磁気細胞分離システム(MACS磁気ビーズシステム)を用いて分離した。分離したNKT細胞はIL-2及びIL-15存在下に、NKT細胞のリガンドであるαGalCerを加え、細胞を常時刺激した。安定して4週間ほど培養できるようになった。
NKT細胞産生サイトカイン・ケモカインのスクリーニング
上述のように培養・増殖させた上で、細胞内タンパク染色&フローサイトメトリー,RNAse protection assayで細胞産生サイトカイン・ケモカインのスクリーニングをおこなった。In vivoでの結果と同様にIL-10をいずれの方法でもNKT細胞が産生することが確認できた。