2005 Fiscal Year Annual Research Report
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16591858
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
野間 隆文 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (40189428)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀口 大吾 徳島大学, 大学院・ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (70304532)
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| Keywords | FRET / アデニル酸キナーゼ / ATP |
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| Research Abstract |
細胞内でのATPの動態をリアルタイムで検出するための道具として、FRETの原理を応用し大腸菌アデニル酸キナーゼ(AK)を利用したATPセンサーの開発を試みた。
まず、蛍光標識の方法を検討し、大腸菌AKの一カ所のアミノ酸をトリプトファンに置換し、これをFRETのドナーとし、一方、AKに一カ所しか存在しないシステイン残基を蛍光標識して、これをFRETのアクセプターとする方針を決定した。次に、大腸菌AKをコードする遺伝子を発現ベクターにつなぎ、AKタンパク質が発現することを確認した。さらに、この発現ベクターを鋳型として、PCRによりAKに変異を導入し、得られた発現ベクターからの三種類のAK変異体の発現誘導も確認した。これらの変異体が活性を有しているかどうか、まずCV2株にトランスフォームして検討した。CV2株は温度感受性であり、外部から活性のあるAKが供給されなければ、42℃で成育することはできない。調べた結果、いずれの変異体も42℃で成育可能であり、アデニル酸キナーゼ活性を有している可能性が示唆された。次に、野生型、および変異型のAKタンパク質の精製法を検討し、最終的に、Blue SepharoseカラムとDE53カラムとを組み合わせることで、95%以上の純度のAKタンパク質を得ることに成功した。最後にこれら、精製したタンパク質のアデニル酸キナーゼ活性を測定したところ、野生型に対して、二種類の変異体はおよそ70%程度の活性を、残る一種類は約30%程度の活性を有していることがわかった。これはいずれの変異体も程度の差はあれ、野生型に近い三次構造を維持していることを示唆している。
今後は、これらのタンパク質のシステイン残基に蛍光標識をして、その標識体が三次構造を維持していることを確認し、さらに基質結合の有無で、発する蛍光スペクトルが変化することを確認する予定である。
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