破骨細胞のruffled-borderに発現するイオン輸送の調節機構

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591878
• Research Institution: Fukuoka Dental College
• Principal Investigator: 岡部 幸司 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (80224046)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 自見 英治郎 福岡歯科大学, 歯学部, 助教授 (40276598)
• Keywords: 破骨細胞 / ruffled border / Cl^-チャネル / 吸収状態 / patch clamp法 / イオン輸送

Research Abstract

破骨細胞のイオン輸送の重要性を明らかにするため、基質上でまさに吸収をしている破骨細胞のruffled border部位のイオン輸送の分子種と破骨細胞の骨吸収機能における役割を明らかにしたいと考えている。平成16年度は、patch clamp法を用い、吸収状態の破骨細胞において、どの様なイオンチャネルが活性化されているかを検討した。実験にはラットやマウスから採集した培養破骨細胞を用いた。まず、リン酸カルシウムコートしたカバーグラス上に吸収窩を形成している破骨細胞とガラスカバーグラス上に培養した非吸収状態の破骨細胞を比較し、細胞がどの様なイオン電流を有するか、各種イオンチャネル阻害剤の効果や細胞内外のイオン組成を変化させながら、イオン輸送の成分を分離し、その性質を調べた。その結果、吸収状態の破骨細胞には、外向き整流性の電流が優位に活性化されていた。この電流はDIDSやNPPBといったCl^-チャネル阻害薬で抑制されることや、細胞内外のCl^-濃度に依存することより、外向き整流性Cl^-電流であることが分かった。また、蛍光色素による細胞内Cl^-やpH測定法を用い、Cl^-チャネル阻害薬や細胞外Cl^-濃度変化による影響を観察した結果、外向き整流性Cl^-電流が破骨細胞のCl^-輸送や細胞内pH変化を調節していることが示唆された。現在、RT-PCR法を用いて、吸収状態の破骨細胞で活性化される外向き整流性Cl^-電流を形成するイオンチャネルの分子種を検索しているが、幾つかのCl^-輸送体が候補として挙がっている。平成17年度は、吸収状態で活性化されるCl^-輸送体の分子種を絞り込むと共に、破骨細胞のruffled border部位での局在の確認や骨吸収機能との関わりも含め、更に検討していきたいと考えている。
なお、申請時に計画していたAxon社のpatch clampアンプは、交付額の削減により購入困難となったため購入を中止し、現有のpatch clampアンプで代用することとした。一方、イオンチャネル分子の細胞内局在の観察が必要となり、キーエンス社の高感度クールドCCDカメラを備品として購入した。