2005 Fiscal Year Annual Research Report
アレルギー患者血清に反応するコムギアレルゲン候補タンパク質の検出と解析
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16613012
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| Research Institution | National Food Research Institute |
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Principal Investigator |
橘田 和美 独立行政法人食品総合研究所, 企画調整部, 主任研究官 (60353926)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川本 伸一 独立行政法人食品総合研究所, 企画調整部, チーム長 (20169775)
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| Keywords | コムギ / アレルゲン候補タンパク質 / 二次元電気泳動 / イムノブロッティング |
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| Research Abstract |
試料として国内産コムギの主要品種である北海道産ホクシンを用いた。コムギタンパク質の抽出条件及び2次元電気泳動の条件等の設定を行った。一次元目の展開範囲としてpI3〜10を選択した。二次元目の電気泳動としSDS-PAGEを選択し、良好な二次元展開像を得られるようになった。しかし、15kDa以下の比較的低分子量のタンパク質については二次元目の電気泳動の泳動先端部に収束してしまい、十分な分離が得られなかった。そこで、低分子量のタンパク質を十分な分離能をもって分離するため二次元目の電気泳動の条件を検討した。低分子量のタンパク質の分離に用いられるTris/Tricine/SDSバッファー系を用いた電気泳動ではタンパク質の抽出に用いた界面活性剤がバックグラウンドとして出現し、分離を妨げた。酢酸-尿素ゲルを用い電気泳動(AU-PAGE)を検討したところ低分子量のタンパク質の優れた分離が認められた。そこで、本研究においては、SDS-PAGEとAU-PAGEを併用して、コムギタンパク質の二次元電気泳動による分離を行った。
アレルゲン候補タンパク質の検出については、市販のコムギアレルギー患者血清を6点入手した。これらの血清を用い、イムノブロッティングを行い患者血清中のIgEが認識するタンパク質をウェスタンブロッティング検出システム(ECLplus)にて検出した。いずれの患者血清においてもIgE結合タンパク質が複数個検出された。検出されたタンパク質について分子量(MW)、等電点(pI)を二次元電気泳動像解析ソフトにより算出した。これらのIgE結合タンパク質のうち、複数の患者血清によって認識されるタンパク質数種について一次構造解析に供した。N末端アミノ酸配列の解析ではピークが認識されず、N末端のブロックが推定された。質量分析(MS)においては、数種のタンパク質について同定に至った。
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