2004 Fiscal Year Annual Research Report
ラット新生仔脳及びCD38ノックアウトマウス脳のADPリボシルシクラーゼの精製
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16650068
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
東田 陽博 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (30093066)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横山 茂 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (00210633)
橋井 美奈子 金沢大学, 医学系研究科, 講師 (10272957)
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| Keywords | ADPリボシールシクラーゼ / CD38 / 膜分画 / NAD / 薄層クロマトグラフィー / 大脳 |
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| Research Abstract |
ADPリボシールシクラーゼ活性の測定
1 新生ラット脳およびCD38ノックアウトマウス脳から膜分画を調整した。
2 膜分画を酵素タンパク源として,[3H]NADを基質およびトレーサーとして用い,ADPリボシールシクラーゼ活性測用ミックスチャーを37℃シエカーバス内(購入予定)でインキュベートした(橋井)。膜分画中に活性が存在することは予備実験にて確認した。
3 ADPリボシールシクラーゼ活性を簡便に測定するため,薄層クロマトグラフィー(TLC)による方法を開発した。アデニレートシクラーゼ活性測定で蓄積したノウハウを生かした。シリカゲル,ポリエチレンイミンTLCに対し,種々の展開剤を試し,アイソトープ標識のNAD, ADPRやcADPRの分離が十分行える条件を見い出した(東田)。
タンパク精製
1.ラット大脳(100g)あるいはNG108-15細胞(200フラスコ分)をタンパク分解酵素阻害剤の存在下でホモゲナイズした。
2.105,000g15分の遠心により粗膜分画を得た。再度遠心を行った。
3.上澄みをブル-Aセファロースカラムにかけ,0.5M NaClで洗った後,0.5M KSCNで溶出した。
4.次に,ヒドロキシアパタイトカラムにかけた。洗浄後0.1Mリン酸で溶出した。
5.マンカナバリンA-セファロースカラムにかけ,0.5M methyl-α-glucopyranosideで溶出した。
6.最後にレットAセファロースで分画した(東田)。
新規のADPリボシルシクラーゼのcDNAクローニングは,精製タンパク質に対する抗体によるクローニングを正道として行った。CD38の酵素活性部位の共通シークエンスよりのホモロジーによりcDNAを作ってくることも考えた(横山・橋井・星)。
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[Journal Article] Probucol aggravates long QT syndrome associated with a novel missense mutation M124T in the N-terminus of HERG.2004
Author(s)
Hayashi K, Shimizu M, Ino H, Yamaguchi M, Terai H, Hoshi N, Higashida H, Terashima N, Uno Y, Kanaya H, Mabuchi H.
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Journal Title
Clinical Science 107
Pages: 175-182
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[Journal Article] Genes required for Drosophila nervous system development identified by RNA interference.2004
Author(s)
Ivanov AI, Rovescalli AC, Pozzi P, Yoo S, Mozer B, Li HP, Yu SH, Higashida H, Guo V, Spencer M, Nirenberg M.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A. 101
Pages: 16216-16221
