in vivoナノ蛋白質工学による神経伝達物質受容体活性化の可視化解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16650083
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 森 泰生 京都大学, 工学研究科, 教授 (80212265)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浜地 格 京都大学, 工学研究科, 教授 (90202259) ; 原 雄二 京都大学, 工学研究科, 助手 (60362456) ; 清中 茂樹 京都大学, 工学研究科, 助手 (90422980) ; 宇山 浩 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70203594)
• Keywords: 光アフィニティーラベル化 / バイオセンサー / アセチルコリン受容体

Research Abstract

昨年度は、in vivoナノタンパク質工学を目的として開発された光アフィニティーラベル化後修飾法が未知の薬の作用部位同定法として利用できることを報告した。
今年度は、実際にその有効性を確認するために、我々が新たに同定した従来とは異なる作用を有する免疫抑制剤の作用部位同定にこの手法を応用した。
まず、免疫抑制剤の作用部位をある程度推測するために、カルシウムイオンの流入阻害について検討した。カルシウムイメージングを利用した結果からこの薬が受容体刺激後のCa2+流入を阻害することを確認できた。流入経路はTRPCチャネルと呼ばれるチャネルであると考えられたので、各サブタイプに対する選択性についてHEK293細胞を用いた評価した。その結果、この薬はTRPC3のチャネル活性を選択的に抑制できることを見出せた。さらにホールセルモードのパッチクランプ法を用いることで、細胞外からこの薬はチャネル活性を阻害することも確認できた。
TRPC3に直接この薬が作用していることを証明するために、本申請内容で提案したアフィニティーラベル化後修飾法を利用した。具体的には、この薬に対応するアフィニティーラベル化剤を有機合成し、TRPC3を過剰発現させたHEK293細胞に作用させた。光照射後に細胞膜画分を回収し、ラベル化後の選択的な修飾反応としてビオチン修飾を行った。反応進行をウェスタンブロッティングにて確認したところ、TRPC3に選択的に反応していることを確認でき、この免疫抑制剤がTRPC3に直接結合している証拠を得ることができた。
以上の結果から、本研究において開発した光アフィニティーラベル化後修飾法が受容体可視化だけでなく、未知の薬の作用部位同定法としても利用できることを実証した。

Research Products

• [Journal Article] Ca^<2+>/calmodulin dependent myosin light chain kinase is essential for activation of TRPC5 channels expressed in HEK cells. (2006)
  • Author(s): Shimizu S, Yoshida T, Wakamori M, Ishii M, Okada T, Takahashi M, Seto M, Sakurada K, Kiuchi Y, Mori Y
  • Journal Title: J.Physiol. 570 Pages: 219-235
• [Journal Article] Comprehensive analysis of the ascidian genome reveals novel insights into the molecular evolution of ion channel genes (2005)
  • Author(s): Okamura Y, Murata Y, Nakajo K, Iwasaki I, Ohtsuka Y, Tanaka-Kunishima M, Takahashi N, Hara Y, Yoshida T, Nishida M, Okado H, Watari H, Meinertzhagen IA, Nishino A, Satoh N, Takahashi K, Satou Y, Okada Y, Mori Y
  • Journal Title: Physiological Genomics 222 Pages: 269-282
• [Journal Article] The non-selective cation permeating channel TRPC3 is a tetrahedron with a cap in the large cytoplasmic end (2005)
  • Author(s): Mio K, Ogura T, Hara Y, Mori Y, Sato C
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Comm. 333 Pages: 768-777
• [Journal Article] The role of canonical transient receptor potential 7 (TRPC7) in B-cell receptor-activated channels. (2005)
  • Author(s): Lievremont J-P, Numaga T, Vazquez G, Lemonnier L, Hara Y, Mori E, Trebak M, Trebak M, Moss SE, Bird GS, Mori Y, Putney Jr JW
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 35346-35351
• [Journal Article] Phoneutria nigriventer ω-Phonetoxin IIA : A new tool for anti-calcium channel autoantibody assays in Lambert-Eaton myasthenic syndrome.
  • Author(s): Martin-Moutot N, Haro LD, Santos RG, Mori Y, Seagar M
  • Journal Title: Neurobiol.Dis. (in press)
• [Journal Article] Intracellular-produced hydroxyl radical mediates H_2O_2-induced TRPM2 channel activation and cell death in rat β-cell line RIN-5F.
  • Author(s): Ishii M, Shimizu S, Hara Y, Hagiwara T, Miyazaki A, Mori Y, Kiuchi Y
  • Journal Title: Cell Calcium (in press)
• [Journal Article] A functional AMPA receptor-calcium channel complex in the postsynaptic membrane.
  • Author(s): Kang, MG, Chen CC, Wakamori M, Hara Y, Mori Y, Campbell KP
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci.USA (in press)
• [Journal Article] A critical role of TRPM2 in neuronal cell death by hydrogen peroxide
  • Author(s): Kaneko S, Kawakami S, Hara Y, Itoh E, Minami T, Takada Y, Kume T, Katsuki H, Mori Y, Akaike A
  • Journal Title: J Pharmacol.Sci. (in press)