蛍光ビーズアレイによる環境微生物群集の迅速モニタリング

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16651007
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 浜崎 恒二 広島大学, 大学院生物圏科学研究科, 講師 (80277871)
• Keywords: 海洋細菌 / ハイブリダイゼーション / マイクロアレイ / 16SrRNA

Research Abstract

本年度は、様々な沿岸海域から分離、同定した海洋細菌の単離菌株を用いて検討を行うと共に、天然海水中の細菌群集の分析を試みた。単離菌株の場合は、標的DNAとして16SrDNAのPCR産物をプライマー標識法でビオチンラベルしたもの用い、天然細菌群集の場合は、抽出した全RNAを化学的標識法で蛍光ラベルしたものを用いた。
マイクロビーズには、標的の配列の一部を特異的に認識するoligo-DNAをカップリング、コントロール(ダミーのoligo)を含む5種類のoligoを使用した。使用したoligo-probeのうち、1種類(CFB probe)のみが有効で、標的DNA量と検出蛍光値の間には正の相関関係が認められた。他のprobeは、ハイブリダイゼーションバッファー、温度、時間などの様々な条件を検討したが、標的DNAを検出することができなかった。相補的なoligoを標的とすると、強いシグナルが得られることから、標的DNAへのアクセスの問題と考えられた。そこで、蛍光標識とoligoをつなぐリンカーを12Cから18Cへ長くすると、検出蛍光値が上昇し、標的DNAへのアクセスが改善された。さらに強いシグナルを得るために、probe認識部位のシフト、プライマーの二重標識、PNAprobeの使用について、単離菌株のPCR産物を用いて検討すると同時に、天然細菌群集のRNA標識産物の分析を行ったが、十分な効果が確認できておらず、さらに検討が必要である。