昆虫の脳由来の単一神経分泌細胞からの新規生理活性ペプチドの発見

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16658049
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 長沢 寛道 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (60134508)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永田 晋治 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (40345179)
• Keywords: カイコ / 脳神経ペプチド / 生理活性ペプチド / 神経分泌細胞 / 分泌性ペプチド / ペプチドホルモン

Research Abstract

カイコを用いて、遺伝子側の情報から脳の神経分泌細胞の新規神経ペプチドを発見することを目的にして以下の実験を行った。
1.カイコ幼虫から脳を摘出した後、コラーゲナーゼで消化して細胞を分散させ、FACSを用いてSSC-FSCドットブロットを作製した。サイズで分離した細胞集団からRNAを抽出し、RT-PCRを行ったが、アクチン遺伝子は増幅されなかった。このことから、細胞調製の過程に問題があると考えられ、これが今後の検討課題である。
2.最終的には1つの細胞からRNAを抽出して、cDNAライブラリーを作製することが目標であるが、まず脳全体を用いてcDNAライブラリーを作製することを試みた。BstXI認識配列をもつオリゴdTプライマーとBstXI認識配列をもつアダプタープライマーを用いて逆転写反応を行い、カイコ脳由来のcDNAを得た。これをテンプレートにしてPCRを行い、アガロースゲル電気泳動により、数百bpから2kbpを越えるまでのスメアなバンドを確認した。このことからRNA抽出するまでの過程に問題はないであろうと考えられる。BstXI処理後、pMEl8Sベクターにライゲーションし、これで大腸菌を形質転換した。現在、インサートをもつコロニーを拾い上げているところである。
3.神経伝達物質であるセロトニンが神経分泌を制御している可能性が考えられたので、RT-PCRによってセロトニン受容体の発現を調べたところ、脳をはじめとする各神経節に発現が認められた。神経分泌細胞を探索する過程でセロトニン受容体遺伝子を発現することを指標に出来る可能性が示された。