2004 Fiscal Year Annual Research Report
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16659344
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| Research Institution | National Research Institute for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
四宮 貴久 国立成育医療センター研究所, RI管理室, 室長 (30196414)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福井 雅之 国立成育医療センター研究所, RI管理室, 流動研究員 (60392502)
刀祢 重信 川崎医科大学, 医学部, 助教授 (70211399)
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| Keywords | ES細胞 / 細胞融合 / 細胞脱核法 / サイトプラスト / 核移植 |
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| Research Abstract |
ES細胞の除核法の条件検討結果--超遠心処理は7,500xgで1時間より8,500xgまたは100,000xgで1時間の遠心の方が脱核効率が良かった。遠心時間は30分より60分の方が良く2時間では収率が落ちた。遠心温度は26度以下では脱核効率が非常に悪く、31〜37℃でほぼ同じ収率を得た。密度勾配に使うFicollは70と400の2種が市販されているが差はなかった。遠心時Ficoll中に10μg/mlのDNaseIを添加しておくと特に細胞密度の高い時の分離が良好であった。注目すべき点はサイトカラシンBの添加がなくても、ES細胞の場合は同様な脱核が行われることが判明した。以上の方法で、収率15-20%、cytoplastの含有率98-99%が得られた。
ES細胞由来のcytoplastの性質--体積は元の細胞の60〜70%。タンパク質あたりのミトコンドリア活性とミトコンドリア量はとも約75%で活性度は余り下がっていないことがわかった。ES培地中での培養は3時間までは変化せずその後24時間では30%のviabilityを示した。Cytoplast調整後3時間以内に実験を終えれば生存には大きな変化はないと予想された。
融合細胞の選択に適したES細胞の改変-ES細胞にHSVチミジンキナーゼを導入しGanciclovilやFIAUで死滅する株を得た。同様にネオマイシン耐性の株も得た。また、選択培地で培養することによりHGPRT欠損株の作成も行った。これらの細胞を用いて融合細胞の選別を行った。
融合法の検討-電気融合法とポリエチレングリコール(PEG)法を検討した。電気融合法は融合効率が高く、一方PEG法は効率は低いが大量の細胞を融合でき、それぞれ長所があり目的に応じて使用することとした。
融合結果-HGPRT欠損のES細胞とTリンパ球や胸腺細胞との融合によるES様の融合細胞を分離することができた。多くは4倍体のDNA量をもっていた。GPIのアイソタイプも両者の形質を示し融合が確認できた。しかしながら脱核したES-cytoplastとリンパ球との融合により、リンパ球のES細胞化には成功していない。
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