2004 Fiscal Year Annual Research Report
MMP-9/RNAiによる癌の浸潤転移抑制と細胞分化療法の開発
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16659560
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
柴田 考典 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60147220)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥村 一彦 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (60194510)
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| Keywords | MMP-9高産生癌細胞 / MMP-9高発現クローン / 癌細胞遊走能 / 基底膜浸潤能 / 細胞接着性 / 細胞間接着分子 / RNAi / 細胞分化療法 |
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| Research Abstract |
研究目的:口腔扁平上皮癌細胞のMMP-9mRNAをsiRNAでノックダウンした際の細胞のシグナル分子や接着分子の挙動を明らかにして、MMP-9を標的としたRNAiによる癌治療効果について検討する。
研究方法:細胞として浸潤能が亢進している培養ヒト口腔扁平上皮癌細胞株SAS-H1、IS-FOM、BSC-OFを用いる。
1.MMP-9高産生細胞の作製:ヒトMMP-9遺伝子はGenBank accession No.NM-004994からRNA sequenceを得て、そのcoding region 377-403をもとにPCRにより全長を得て、lacZ-レポーター遺伝子プロモーター領域をつないだアデノウイルスプラスミドベクターを用いて遺伝子導入を行う。G418の選択培地でMMP-9高発現クローンを得た後、MMP-9産生をゼラチンザイモグラフィで確認する。
2.MMP-9高発現クローンの浸潤性への影響:Transwell chamber上に2×10^4個の細胞を播種して、培養後16時間経過し8μmのporeを有するpolycarbonate filterを通過した細胞数を測定し細胞遊走能を評価する。また、培養後72時間経過し再構成基底膜matrigel^<TM>をコートした同数のpolycarbonate filter (30μg/filter)を通過した細胞数を計測し、基底膜浸潤能として評価する。さらに基底膜基質としてmatrigel^<TM>、fibronectin、laminin、collagen typeIIIおよびcollagen typeIVをそれぞれコートした35-mm培養皿(BIOCOAT Cellware : BD lab)に1×10^5個の細胞を播種して、培養後6時間経過時の培養皿底面に付着した細胞を回収し、ヘモサイトメーターで計測し、細胞接着性のの評価を行う。
結果:1.MMP-9高発現クローンを作製し、MMP-9産生をゼラチンザイモグラフィで確認中である。2.クローン株の細胞遊走能、基底膜浸潤能、および細胞接着性について計測中である。
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