骨再生を目指した転写因子Osterixの機能調節機構の解明

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16659567
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 加我 正行 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教授 (70125300)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉村 善隆 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (30230816) ; 出山 義昭 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教授 (80271667)
• Keywords: オステリックス / 転写因子 / 骨芽細胞様細胞

Research Abstract

Osterix全長(a.a.1-429)および各種deletion変異体(OST-A(a.a.1-141),OST-B(a.a.140-280),OST-C(a.a.280-429),OST-B1(a.a.140-210),OST-B2(a.a.210-280),OST-B3(a.a.170-250),OST-B4(a.a.140-250),OST-B5(a.a.170-280))をGAL4-DNA-binding domainと連接させた発現plasmidを作製した。GAL4-binding sitesと連接させたルシフェラーゼreporter plasmidと各種発現Plasmidを骨系培養細胞(MG-63)に導入し、ルシフェラーゼアッセイにより転写活性化能を検討した。
Osterix全長を3分割したOST-A,OST-B,OST-C領域を比較したところ、middle領域のOST-Bに強力な転写活性化能が確認された。さらに、OST-B領域をOST-B1からB5までのdeletion変異体を用いて解析したところ、プロリンリッチなOST-B1領域が転写活性化最小領域であることが明らかとなった。
また、OST-B1領域の転写活性化能は各種組織由来動物細胞(HeLa,293T,HepG2,MG-63)および酵母細胞において機能することが確認された。
さらに、G418耐性遺伝子を有したOsterix発現plasmidを作製し、薬剤選択によりOsterix遺伝子をstableに過剰発現するSaOS2細胞(f-Osterix SaOS2)を樹立した。f-Osterix SaOS2と親株SaOS2細胞からRNAを抽出、発現遺伝子パターンの比較を行った。RT-PCR法により骨芽細胞特異的遺伝子群の発現について検討したところ、Osterix導入によりオステオカルシンmRNAの亢進が確認できた。