2005 Fiscal Year Annual Research Report
紫外線感受性の異なるイネのシクロブタン型ピリミジンニ量体光回復酵素の構造の違い
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16710028
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
寺西 美佳 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 助手 (10333832)
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| Keywords | 紫外線UVB / イネ / シクロブタン型ピリミジン二量体 / 紫外線耐性機構 / CPD光回復酵素 / DNA損傷 / 植物 / 酵素活性 |
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| Research Abstract |
(1)UVB抵抗性の異なるイネ品種のCPD光回復酵素の構造・機能の解析
CPD光回復酵素タンパク質を、日本型イネ品種ササニシキの可溶性タンパク質から、次のように精製した。硫酸アンモニウム濃度30-70%で沈殿するタンパク質画分を取得し、脱塩操作後、陰イオン交換カラムに供し、80mM NaCl,pH7.2の条件下において結合しない画分を取得した。この画分をヘパリンカラムに供し、結合した画分を1M NaClを含む緩衝液で溶出したのち、脱塩操作を行った。この画分を、CPDを含むDNAを結合させた磁気ビーズと混合した。CPD光回復酵素は、青色光を受容してCPDを修復した後、DNAから遊離することが知られている。そのため、CPDを含むDNAを結合させた磁気ビーズに結合したタンパク質に、青色光を照射することで、修復活性をもつCPD光回復酵素をDNAから遊離させ、磁石を使用して磁気ビーズを沈殿させることで、上清画分にCPD光回復酵素を特異的に得ることができた。この精製タンパク質は、タンパク質量あたりの酵素活性が、可溶性タンパク質画分と比較して約8100倍に上昇していた。得られたタンパク質には2種類のCPD光回復酵素が含まれていたため、2種類のCPD光回復酵素の分離解析を進めている。
(2)CPD光回復酵素の違いがUVB抵抗性を左右する主要因であることの検証
ササニシキのCPD光回復酵素遺伝子を、センス、またはアンチセンス方向に導入したバイナリーベクターを用い、アグロバクテリウム法にてササニシキ、農林1号、Surjamkhiの種子胚から誘導したカルスに遺伝子導入を行い、形質転換体の作成を行った。カルスから再分化させ得た植物体を生育させ、その後代世代の種子を取得した。後代世代の種子を取得するとともに、遺伝子発現量の解析、酵素活性の測定、UVB感受性の検定を進めている。
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