2004 Fiscal Year Annual Research Report
脂肪族炭素ハロゲン化に関わる新規ハロゲン化酵素の機能研究
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16710159
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| Research Institution | Tamagawa University |
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Principal Investigator |
大塚 みゆき 玉川大学, 農学部, 講師 (70365873)
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| Keywords | halogenase / neocarzilin / biosynthesis / expression / gene disruption |
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| Research Abstract |
ネオカルジリン生合成遺伝子クラスター中に存在する新規ハロゲン化酵素遺伝子の機能同定を目的として、本遺伝子の遺伝子破壊を行った。外来遺伝子挿入による遺伝子破壊用プラスミドを構築しネオカルジリン生産菌株に形質転換、相同性組み換えによる標的遺伝子破壊株を単離、その代謝産物の分析を行った。その結果、分析したすべての破壊株でネオカルジリン生産が検出されず本遺伝子がネオカルジリン生合成に関わることが強く示唆されたが、期待されたパロゲン化されていないネオカルジリン類縁化合物の生産は確認されず、本遺伝子がネオカルジリンハロゲン化に関わるという確証は得られなかった。
さらにネオカルジリン骨格生合成に関わる遺伝子クラスターと本ハロゲン化酵素遺伝子を異種放線菌に形質転換し共発現させた。この形質転換体の代謝産物を分析したところネオカルジリン骨格の生産は確認されたが、期待されたネオカルジリンは検出できなかった。
in vivoにおいて本酵素のパロゲン化活性を確認することができなかったため、酵素活性のin vitroでの確認、さらに酵素反応機構解明を目指して本酵素の大量発現系の構築を行った。T7プロモーターを利用した強力な大腸菌発現系であるpETシステムを利用した発現プラスミドを構築し、大腸菌ホストに形質転換、タンパク質発現を誘導した。種々の発現プラスミド形質転換体において期待された分子量のタンパク質の高発現が認められたが、ほとんどの発現タンパクが不溶性画分に分画された。発現ベクター、ホスト、誘導条件等を検討した結果、チオレドキシン融合タンパクとして低温で発現を誘導した場合に一部の発現タンパクが可溶性画分に分画されることを見出した。
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