2005 Fiscal Year Annual Research Report
マウスにおけるミトコンドリアDNA母性遺伝を規定する原因の解明
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16770009
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
設楽 浩志 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90321885)
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| Keywords | ミトコンドリア / mtDNA / 母性遺伝 |
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| Research Abstract |
精子由来ミトコンドリアが排除される時期を詳細に特定するために、野生型であるC57BL/6J(♀)とmtGFP-Tgマウス(♂)を用いた体外受精を実施し、精子由来ミトコンドリアのEGFPのシグナルが消失する様子を共焦点レーザー顕微鏡により解析した。また、マウス精子形成過程における雄性生殖系列細胞におけるmtDNAコピー数の測定を行うために、野生型であるC57BL/6J(♂)の精巣から機械的調整法により細胞を分離し、精母細胞、円形精細胞、伸張期円形精細胞、精子および残余体を単離した。DNA精製の過程で起こりうる試料の損失を防ぐために、単一の細胞をプロティナーゼK(P.K.)-非イオン性界面活性剤反応液中に導入し、得られた反応液は95℃でP.K.を失活させ、そのまま次のPCR法に用いる方法を採用した。リアルタイムモニタリングPCR法(RTD-PCR法)によりmtDNAを選択的に増幅するために、特異的なプライマーおよび両末端を蛍光標識したプローブを作製した。段階希釈したコントロールコピーの増幅曲線から、用量反応曲線を作製し、同時に目的の試料中に存在するmtDNAのコピー数を測定し、PCR後の増幅産物はアガロースゲル電気泳動法により展開し、非特異的な増幅のないことを確認した。その結果、それぞれの細胞群の間では細胞あたりのmtDNAコピー数に大きな差が観察され、最大でおよそ1000倍の差があることがわかった。現在、その原因について、分子生物学的解析を行っている。
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