2004 Fiscal Year Annual Research Report
癌転移抑制剤の標的タンパク質・パキシリンのX線結晶構造解析
| Project/Area Number |
16790069
|
|---|
| Research Institution | Osaka Bioscience Institute |
|---|
Principal Investigator |
廣瀬 まゆみ (財)大阪バイオサイエンス研究所, 分子生物学部門, 研究員 (00353524)
|
|---|
| Keywords | パキシリン / X線結晶構造解析 / リン酸化タンパク質 |
|---|
| Research Abstract |
パキシリンの構造は大きく二つの構造からなる。すなわち、N末端部分はチロシンリン酸化部位および5つのLDモチーフから構成され、C末端部分は4つのLIMドメインから構成されている。パキシリンのTyr31/Tyr118およびTyr40/Tyr181はN末端部位に含まれており、当該研究ではパキシリンのN末端部位のGST融合パキシリンを作製し立体構造解析を試みた。
はじめに、パキシリンのX線結晶構造解析を行うために、GST融合タンパク質の作製を行った。すなわち、パキシリンのN末端部分をバキュロウイルス発現系および大腸菌発現系により、組み替えGST融合タンパク質を得た。次に、得られたタンパク質をグルタチオンセファロースカラムおよびゲル濾過にて精製し、精製パキシリンをシッテイングドロップ法により結晶化を行い微結晶を得た。今後、さらにNASDAの施設を使った無重力状態での結晶化を試みる予定である。
さらに、平成17年度に予定していた「リン酸化パキシリンタンパク質の精製とX線結晶構造解析」のためにTyr31/tyr118あるいはTyr40/tyr181をリン酸化を受けないPheに変異させたパキシリンを変異させていないパキシリンと同様にバキュロウイルス発現系にてタンパク質を作成し、mgオーダーで純度95%のタンパク質を得ることに成功した。Pheに変異させたパキシリンにSrcなどのキナーゼを作用させ、in vitroにおけるパキシリンのリン酸化を行い、リン酸化パキシリンをイオン交換クロマトグラフィーで分離後、質量分析計にてリン酸化の確認を行い、パキシリンがTyr31/tyr118あるいはTyr40/tyr181のみがリン酸化されていることを確認した。今後、これらの変異パキシリンを結晶化する予定である。
|
