灌流培養型連続発光モニター系を用いた概日リズムの同調機構解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16790148
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 中島 芳浩 独立行政法人産業技術総合研究所, セルエンジニアリング研究部門, 研究員 (10291080)
• Keywords: 概日リズム / ルシフェラーゼ / 遺伝子発現 / 灌流培養

Research Abstract

体内時計の作り出す自律的リズムの周期は正確に24時間ではないため、環境サイクルとの時間差を同調機構によって日々修正(リセット)している。本研究は新規灌流型連続発光モニター系を用い、時計遺伝子を非侵襲的に連続してモニターすることで、生体リズムの同調機構の解明を目的としている。本年度は、灌流培養型モニター系の基盤構築と検証を試みた。概日時計遺伝子Bmal1のプロモーター領域下流に代表的なレポーター酵素であるホタルルシフェラーゼcDNA(FL)を、更にその下流にinternal ribosomal entrysiteを介し、ウミホタル(Cypridina noctiluca)由来の分泌型ウミホタルルシフェラーゼcDNA(CL)を組込み、Bmal1プロモーター発現に伴い2つのルシフェラーゼがdicistronicに発現するベクターを構築した。続いてこのベクターをラット繊維芽細胞Rat1に導入、安定細胞株を作製し、このモデル細胞を用いて我々が構築した灌流培養系の検証を行った。灌流培養系において安定した概日振動がモニター出来るかをFL活性を指標に、灌流培養液中に分泌されるホルモン量の変動等のモニターが可能かを培養液中のCL活性を指標に検討した。FL活性は灌流液に添加したホタル・ルシフェリンとの反応によって生ずる細胞内の発光を光電子倍増管によりリアルタイムに測定、CL活性は培養液を30分間隔で分画し、測定終了後に全画分をまとめ測定した。細胞を1ml/hrの速度で4日間灌流培養し、各々の発光活性を測定したところ、FLとCLの両活性ともに約24時間の周期で変動し、それらの位相も同期していたることが明らかとなり、灌流培養系が同調機構解析のための遺伝子発現モニター系として有用であることが判明した。