2005 Fiscal Year Annual Research Report

Two-hybrid systemを用いたタイラーウイルスの脱髄発症機構の解析

Research Project

Project/Area Number	16790497
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	紺谷靖英金沢医科大学, 医学部, 助手 (30367461)
Keywords	タイラーウイルス / L蛋白 / L^*蛋白 / Two-hybrid system
Research Abstract	タイラーウイルスのDA株による持続感染・脱髄にはポリ蛋白の量もN末端に位置するL蛋白とL蛋白の翻訳領域と重複して翻訳されるL^蛋白が重要な役割を担っていると考えられている。L及びL^蛋白は合成後、ウイルス粒子には取り込まれず宿主細胞内に残存する。そこで本研究では、two-hybrid systemを用いてL及びL^蛋白と相互作用する宿主因子の検索を行った。L蛋白を用いた検索の結果、脳及び脾臓由来のcDNAライブラリーから32と132個の陽性クローンがそれぞれ得られた。同様に、L^蛋白を用いた検索の結果、32と224個の陽性クローンがそれぞれ得られた。異なる2種類のcDNAライブラリー間で重複するクローンを検索した結果、L蛋白からはclathrin-associated protein AP50(AP50)が同定された。また、L^蛋白からはcathepsin Bが同定された。L蛋白とAP50蛋白を用いたfar-Western blottingによるin vitro解析から両蛋白間の会合が確認された。また、293T細胞を用いたmammalian two-hybrid systemによるin vivo解析からもL蛋白とAP50の会合を示す結果が得られた。このAP50は会合標的分子内のチロシンモチーフを認識して会合することから、L蛋白内の2箇所のチロシンモチーフYPDVとYLLLをHPDVとHLLLにそれぞれ変異させたL蛋白を用いて会合を検討した。その結果、変異導入したL蛋白は野生型L蛋白よりもAP50との会合が低下した。このことから、L蛋白とAP50は真核細胞内で確実に会合することが明らかとなった。一方、L^蛋白は不溶性蛋白として発現したことから、L蛋白と同様の確認実験を行うことができなかった。L蛋白と相互作用を示したAP50はclathrin被覆小胞を形成するAP-2複合体の構成要素であり、最近の研究からT細胞の負の調節因子であるCTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4)のエンドサイトーシスに関与すると報告されている。すなわち、L蛋白はclathrin-associated protein AP50と会合することにより、CTLA-4のエンドサイトーシスを阻害し、持続的にCTLA-4を発現させると考えられる。CTLA-4の持続的発現は感染防御反応の抑制につながり、タイラーウイルスの持続感染に有利に働くと考えられる。