ヒトグラニュライシンのリコンビナント発現と機能解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16790655
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 宮田 聡子 北里大学, 医学部, 講師 (30260855)
• Keywords: 抗菌タンパク / グラニュライシン / 殺菌活性 / 抗腫瘍活性

Research Abstract

グラニュライシンは、ヒトのキラーT細胞やナチュラルキラー細胞(NK)細胞に存在する顆粒タンパクの1つであり、近年その抗腫瘍効果が明らかにされ、悪性腫瘍の治療の一端を担う可能性が示されている。一方、グラニュライシンには殺菌作用があることが知られるようになり、結核菌やブドウ球菌などの病原微生物に対し殺菌能を有し、特にMRSA等の抗生物質耐性の細菌に対しても殺菌的に働くためその役割が注目されるようになった。
本年度の研究は、グラニュライシンのリコンビナント発現と精製を主に展開した。ヒト末梢血単核球をリコンビナントIL-2存在下で培養し、LAK細胞を誘導した。常法に従いLAK細胞よりtotal RNAを抽出しcDNAを合成後、グラニュライシン特定領域に制限酵素Nde1部位を付加してPCRにて増幅した。pET28aベクターのNde1サイトに、増幅した238bpをクローニングしE.Coli B株由来Rosetta(DE3)にエレクトロポレーション法により導入した。シークエンスによりインフレームを確認し、ヒスチジン融合蛋白として発現させたが、発現量は非常に少なかった。グラニュライシンが抗菌蛋白であることを考慮し、宿主大腸菌内で封入体となるように発現量を調節し、分収採取型電気泳動装置および分収採取型等電点電気泳動装置を用い、変性条件下に精製条件を検討している。