腎移植における急性拒絶反応のリアルタイム定量的PCR法を用いた早期診断法の確立

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16790913
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 伊藤 慎一 岐阜大学, 医学部附属病院, 助手 (70324308)
• Keywords: 拒絶反応 / リアルタイム定量的PCR / LightCycler / 腎移植 / リンパ球表面マーカー

Research Abstract

腎移植を含めた臓器移植の拒絶反応の判定は、病理組織学的検査以外の方法は確立していない。病理組織学的判定法は腎移植に関しては国際的な基準が決められてはいるが、客観的判断という点では十分とは言い難い。今までに移植腎組織に浸潤するリンパ球のサブクラスの定量は行われておらず、移植腎組織内におけるリンパ球サブクラスの構成を明らかとする事により、その構成の特性により早期に急性拒絶反応を診断に応用できる可能性が有ると考える。今回我々は表面マーカーを用いたTリンパ球のサブクラスの同定の代わりに、表面マーカーのmRNAを用いたリアルタイム定量的PCRを実施することで、簡便に急性拒絶反応を診断する方法を確立したい。我々が平成13年度に交付を受けた科学研究費補助金で行った症例研究で用いた手法と同様の方法により皮膚移植マウスの作製し、急性拒絶反応を人工的に起こす。このマウスの拒絶反応部位の組織を採集し、組織学的検索を行い、同時にmRNAを抽出して、cDNAに変換して凍結保存する。更に、フローサイトメトリーを行うための検体を採取している。
リンパ球の表面マーカーのmRNAを検出するためのリアルタイム定量的PCRを確立する。hybridization probe法用の数種類のprimerとprobeをデザインし、その至適化を検討中である。
今後、マウス検体を用いて表面マーカーの発現量と、急性拒絶反応のタイプ、更にその強さと比較し、LightCyclerによる急性拒絶反応判定基準を作成する。
腎移植症例のプロトコール生検時にPCR用の検体を同時に採取し、mRNAを抽出後cDNAに変換し凍結保存しておく。