2004 Fiscal Year Annual Research Report
トランスジェニックマウスと培養網膜神経節細胞を用いた視神経障害機序研究
Project/Area Number |
16791044
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Research Institution | University of Yamanashi |
Principal Investigator |
間渕 文彦 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助手 (20322125)
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Keywords | 緑内障 / 網膜神経節細胞 / マウス / Thy1 / GFP / コラーゲン |
Research Abstract |
網膜神経節細胞(RGC)の特異的蛋白であるThy1蛋白遺伝子にgreen fluorescent protein (GFP)遺伝子をtransgenicさせることにより、青色光にてRGCが自発蛍光するトランスジェニックマウス(RGC蛍光蛋白発現マウス)、matrix metalloproteinase 1によりコラーゲンIが代謝されないためコラーゲンIが生体内に蓄積し、眼圧上昇、RGC障害のみられるトランスジェニックマウス(コラーゲンタイプI代謝異常マウス)を購入し、繁殖実験を行った。これらマウスのgenotypingを行い、ホモ遺伝子変異マウスと遺伝子変異のない野生型マウスを同定した。また、これらホモ遺伝子変異マウスのRGCが、野生型マウスRGCと同等の細胞活性を有するかをin vitroの系で検討するためにはRGCの単離培養系を確立する必要があるが、これまでマウスRGCの単離培養系の報告がないため、マウスRGCの単離を、BarresらがラットのRGCを単離する方法として報告した2 step panning法をもとに試みた。生後3日以内のマウス眼球を摘出し、網膜を脈絡膜より剥離、triturationにより網膜細胞を取り出した。これら網膜細胞を抗マウスマクロファージ抗体に感作させた後、抗IgG抗体でコートした第1panningプレートにてマクロファージを除去、さらに、抗マウスIgM抗体、抗Thy1抗体でコートした第2panningプレートにてRGCを単離した。単離されたRGCの純度を評価するため、リジン・ラミニンコートスライドガラス上にてThy1抗体を用い免疫染色を行うと共に、RGC蛍光蛋白発現マウスよりRGCを単離し、RGCが自発蛍光を示すことを利用してRGCを同定した結果、高純度でRGCが単離されていることを確認した。
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