コンディショナルノックアウト法を用いた慢性関節リウマチ病因因子RA‐A47の解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16791124
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 服部 高子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (00228488)
• Keywords: RA-A47 / HSP47 / 関節リウマチ / 炎症性サイトカイン / ノックアウトマウス / CD9 / アポトーシス / アンチセンスオリゴヌクレオチド / 自己抗原

Research Abstract

関節リウマチ関連抗原RA-A47/HSP47はヒト軟骨細胞株HCS-2/8より関節リウマチ患者血清との反応性を指標に単離されたコラーゲン特異的分子シャペロンである。このHSP47は、関節リウマチ時に関節液中に放出されている炎症性サイトカイン刺激によりその発現量が減少することが当初の研究より明らかになっており,それと同時に軟骨細胞には誘導型NO合成酵素(iNos)、マトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)-9などの細胞障害性因子が誘導される。
また、本来細胞内の小胞体膜上に限局するRA-A47の細胞表面への露出,細胞外への放出が確認され、この様な現象がHSP47の自己抗原としての認識や関節リウマチの病態形成に寄与していると考えてきた。しかし、関節リウマチの発症機構は依然として不明であり、研究代表者は、HSP47の発現量減少が病態誘導に起因しているのではとの仮説のもと、今回HSP47アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加する事により,炎症性サイトカインを介さず特異的に同遺伝子の発現を抑制し,その効果を調べた。その結果,iNOS, MMP-9の遺伝子発現はRA-A47の発現量低下とともに上昇する一方、TNFαは誘導されなかった事から、これらの分解性因子の誘導は、TNFαを介さない、直接的な作用に起因している事が示唆される。さらには、HSP47の局在も細胞内から細胞表面に変化しており、また、その局在はCD9と一致していた。このCD9は、HSP47が細胞表面へ露出した事を伝えるシグナルを細胞内に伝えるだけでなく、細胞表面にHSP47をつなぎ止めていると我々は考えている。HSP47特異的発現抑制は、複数のアポトーシスマーカーも誘導した。これらの結果から,HSP47の発現量減少がアポトーシスを含めた軟骨破壊も誘導する事を示唆した(論文発表)。
さらにHSP47の軟骨組織における発現量減少の影響を生体内で調べるために研究代表者は2型コラーゲンプロモーターを用いてCre遺伝子を発現させ,軟骨組織特異的にHSP47遺伝子の欠失を誘導するコンディショナルノックアウトマウスを作製している。現在,bacterial artificial chromosomal library(BAC library)より129マウス由来HSP47 genomic DNAの単離,制限酵素地図の作製を終了し、ターゲティングベクターの構築を行っているところである。
次年度までにターゲティングベクターの構築,ES細胞への導入,組換えES細胞の選別,キメラマウスの作製を行う予定である。

Research Products

• [Journal Article] Downregulation of rheumatoid arthritis-related antigen RA-A47 (=HSP47/Colligin-2) in chondrocytic cell lines induces apoptosis and cell-surface expression of RA-A47 in association with CD9. (2005)
  • Author(s): Hattori, T, von der Mark K., Kawaki, K., Yutani Y., Kubota S., Nakanishi, T., Eberspeacher H., de Crombrugghe, B., Takigawa, M.
  • Journal Title: J.Cell.Physiol. 202 Pages: 191-204