唾液腺癌由来α-N-アセチルガラクトサミニダーゼのクローニングと機能解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16791268
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 松浦 隆 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (10298408)
• Keywords: α-N-acetylgalactosaminidase / クローニング / 蛋白精製 / ポリクローナル抗体 / 頭頸部癌

Research Abstract

【目的】頭頸部癌細胞から抽出したα-N-acetylgalactosaminidase蛋白の生化学的性質を検討するとともに、精製蛋白に対する抗体を作製することを目的とした。
【方法】本研究では、1 唾液腺癌細胞から細胞抽出液を調製し、イオン交換ゲルクロマトグラフィーに供した。2 イオン交換ゲルクロマトグラフィーからα-N-acetylgalactosaminidase活性を示す蛋白分画を回収し、ゲルクロマトグラフィーに供した。3 ゲルクロマトグラフィーで精製された蛋白分画をSDS-PAGEで展開し、分子量を求めた。4 精製蛋白を、ウサギに免疫し、抗ヒト唾液腺癌由来α-N-acetylgalactosaminidase活性蛋白抗体を作製した。5 抗体の力価は、ELISAで測定した。
【結果】1 唾液腺癌細胞から蛋白を抽出し、イオン交換ゲルクロマトグラフィーで展開したところ、#76のフラクションを中心としてα-N-acetylgalactosaminidase活性物質が分離された。これらのフラクションをゲルクロマトグラフィーで分離したところ、#58のフラクションでα-N-acetylgalactosaminidase活性物質が分離された。2 #58のフラクションを濃縮し、SDS-PAGEで展開した結果、約48kDaのシングルバンドを得た。3 本精製蛋白は、exo-とendo-α-N-acetylgalactosaminidase活性を有する特徴がみられた。4 本蛋白を濃縮し、ウサギに免疫した結果、ポリクローナル抗体を得た。5 ポリクローナル抗体はELISAによってその特異性が確認された。
現在、得られた抗体を用いてクローニングを継続中である。