2017 Fiscal Year Annual Research Report
A molecular design of molecular-targeting peptides (mid-size medicines) with cell membrane permeability.
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16H01882
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
藤井 郁雄 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70189984)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 大佑 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (30611420)
道上 雅孝 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (60802428)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子標的医薬 / ペプチド / 進化分子工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
進化分子工学（細胞表層ディスプレイ技術）とペプチド構造構築理論を組み合わせることにより，細胞内送達を可能にし，細胞内タンパク質をターゲットとする分子標的ペプチド（中分子化合物）の新しい設計法を開発する。すなわち，強固な立体構造（ヘリックス・ループ・ヘリックス構造: HLH）をもつペプチドの細胞表層提示ライブラリーを構築し，標的タンパク質に結合するペプチドをスクリーニングする。得られるペプチドは立体構造を持っているので，生体内の酵素分解に対しても安定であり，抗体と同等の高い特異性と強い結合活性をもつ。この分子標的HLHペプチドを「マイクロ抗体」と呼ぶ。そこで，このペプチドを利用して，特定の細胞を標的し細胞内に効率良く送達される分子標的中分子の開発を行う。本研究によって，標的タンパク質が細胞内タンパク質にまで一挙に及ぶことになり，ケミカルバイオロジーの進展に貢献するとともに，医薬品開発においても対応可能な疾患の範囲が大きく広がる。28年度にヘリックス・ループ・ヘリックス構造をもつ立体構造規制ペプチドを設計し，ヘリックス部分，ループ部分，ヘリックス部分＋ループ部分の３種のライブラリーを構築した。さらに，そのファージ表層提示ライブラリーを作製した。これらのライブラリーを血管内皮細胞増殖因子（VEGF）に対してスクリーニングしたところ，安定なヘリックス構造をもつVEGF結合ペプチド（Kd = 0.7 nM）の獲得に成功した。29年度は，本VEGF結合ペプチドの生体内安定性を検討した。また，プロテイン・グラブティングによるマイクロ抗体の設計を検討し，細胞内のp53とMDM2とのタンパク質－タンパク質相互作用を阻害するペプチドの獲得に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)マイクロ抗体の生体内安定性：マイクロ抗体の分子標的医薬としての潜在能力を評価した。マイクロ抗体は立体構造を持つことにより，抗体と同様に，高い特異性と親和性さらに生細胞内での安定性（酵素抵抗性）を獲得することができる。そこで， 前年度に得られたVEGF結合性マイクロ抗体をペプチド合成し， CDおよびNMRにより立体構造を解析した。その結果，安定したhelix-loop-helix構造を持つことが明らかになった。また，酵素抵抗性を検討した。トリプシンと反応させ経時的の残存ペプチド量を測定したところ，強い酵素分解抵抗性を観測した（半減期：20時間）。さらに，チオレドキシン融合ペプチドを合成し，細胞増殖阻害活性を測定した。その結果，本ペプチドが，ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）のVEGF添加による細胞増殖を阻害することが判明した（IC50: 200 nM）。
(2) 立体構造情報に基づくマイクロ抗体の開発：プロテイン・グラブティングによるマイクロ抗体の設計を検討した。X線構造から得られる立体構造情報をもとに，分子認識に必要なアミノ酸残基を土台ペプチドに移植し，目的のマイクロ抗体を設計する。本研究では，p53とMDM2とのタンパク質－タンパク質相互作用を分子標的とした。この相互作用では，p53のヘリックス部分がHDM2と結合しており，その結合に関与するp53ヘリックス上のアミノ酸を，マイクロ抗体のC末端ヘリックス上に移植した（エピトープ・グラフティング）。さらに，構造支持領域であるN末端ヘリックス上にポリアルギニンなどの細胞膜透過性ペプチド配列を移植した（アルギニン・グラフティング）。得られたペプチドは，MDM2と強く結合し，p53とMDM2との相互作用を阻害した。さらに，本ペプチドのがん細胞増殖阻害活性を検討したところ，ヒト結腸腺ガン細胞の増殖を完全に阻害した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)マイクロ抗体の細胞膜透過性の検討および膜透過性ペプチドの導入：巨大タンパク質である抗体は細胞膜透過性がないため，細胞内の重要なタンパク質を標的にすることができない。一方，マイクロ抗体の分子サイズは小さく，細胞膜透過性もつ可能性があり，抗体に比べ大きなメリットである。そこで，MDM2結合性マイクロ抗体を蛍光分子で化学修飾し，蛍光を指標にして細胞膜透過性を検討する。また，本マイクロ抗体が細胞膜を透過しない場合は，N末端に膜透過性ペプチドであるポリアルギニンを導入する。
(2) マイクロ抗体－薬物複合体の合成：VEGF結合するマイクロ抗体に,チューブリンの重合阻害剤である抗腫瘍性抗生物質を導入し，マイクロ抗体－薬物複合体を合成する。この複合体は，エンドサイトーシスにより細胞内に移行し，細胞内でジスルフィド結合が開裂し，薬物を放出する。マイクロ抗体－薬物複合体は，抗体－薬物複合体に代わる新しい薬物送達法であり，これを，PDC(Peptide Drug Conjugate)と名付ける。
(3)マイクロ抗体の抗原性試験：マイクロ抗体と担体タンパク質の縮合体を合成する。１）マイクロ抗体のみ，２）マイクロ抗体＋アジュバント，３）マイクロ抗体-KLH縮合体の３種の抗原で免疫し，血中の抗体産生量をELISAで検証する。
(4) 細胞膜透過性マイクロ抗体およびマイクロ抗体－薬物複合体の生物活性：細胞膜透過性マイクロ抗体およびマイクロ抗体－薬物複合体について，細胞アッセイを行い，生物活性を評価する。抗VEGF分子標的化合物に関しては，ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を用いる。抗MDM2分子標的化合物に関しては，ヒト結腸腺ガン細胞を用いて，ガン細胞増殖阻害活性を検討するとともに，アポトーシスやセルアレストなど各種バイオマーカーを調べることにより作用機序を明らかにする。
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