2017 Fiscal Year Annual Research Report
完全抗体をスーパー抗体酵素に変える革新的技術の開発
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16H02282
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
一二三 恵美 大分大学, 全学研究推進機構, 教授 (90254606)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 龍一 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (50240833)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 抗体酵素 / X線結晶構造解析 / 抗体 / 酵素活性 / 軽鎖定常領域 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「抗体を抗体酵素化する」という目標を達成するために、本年度は高い活性を示す抗体酵素の抽出と構造決定に注力する計画であった。昨年度までの知見を基に検討項目を増やした結果、「抗体の抗体酵素化」に向けた重要な手掛かりを得ることが出来た。
(1)軽鎖クローンの構造安定性：軽鎖クローンの構造均一化法を確立し、発現・精製していたが、保存中の構造変化が示唆された。結晶化のために解決すべき課題であるため、精製方法を改良し、この方法で調製した12クローンについて長期の安定性を確認した。
(2)X線結晶構造解析：軽鎖ライブラリーはC末端にHis-tagを付加したConstructであるため、His-tagの前にPre-Scission siteを導入し、精製後にHis-tagを除去して結晶化スクリーニングを行った。この手法により、解像度2.6Aで核酸分解型軽鎖クローンの構造決定に成功した。同様の手法で抗体酵素化すべき抗体候補のInfA-15 mAbの軽鎖についても結晶化を進めており、回折実験に供する結晶化の目処が立った。
(3)抗体酵素の高活性化：昨年度までの検討で、「軽鎖定常領域ドメインが軽鎖タンパクに構造多様性を齎す要因である」という知見を得ている。この知見に基づいて軽鎖タンパクの可変領域ドメイン単独での発現を試みた。1クローンについて発現と精製に成功し、合成基質を用いた酵素活性試験では、軽鎖全長と比較して高い酵素活性を示すことを確認した。
(4)軽鎖配列と酵素活性の関係：高い活性を示す軽鎖クローンを抽出するためのスクリーニングを行い、酵素活性とアミノ酸配列の関係を精査した。軽鎖全長約220残基のうち、1～2残基の配列の差が酵素活性の有無に大きく影響するものや、酵素活性を発揮するクローンに共通して見られる配列上の特徴を見出し、「抗体の抗体酵素化」のための重要な知見を得ることが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初計画では、抗体酵素の構造を決定し、構造情報から活性サイトの同定を進め、変異導入などの確認実験進める「構造ベース」のアプローチを進める計画であった。抗体タンパクの結晶化は困難であることが知られており、抗原との複合体形成による構造安定化が試みられている。本研究では、単に結晶化のための技術的なアプローチではなく、抗体に構造多様性が見られる本質的な理由を明らかにし、これを踏まえた構造の均一化にも挑戦している。昨年度に得た「抗体軽鎖の定常領域ドメインが構造多様性の要因になっている」という重要な知見を基に可変領域単独での発現を試み、高活性化に成功したことは、非常に意義深い。
また、「His-tagを外して結晶化させる」という常法による構造安定化においても良好な結果を得ており、核酸分解能を持つ軽鎖型抗体酵素クローンのX線結晶構造解析に世界で初めて成功した。抗原認識部位周辺は、核酸分解能を有する完全抗体型抗体酵素と類似の構造を持ち、核酸と相互作用すると考えられるアミノ酸残基が同じ位置に配置していた。これは、酵素活性サイトの同定に大きく近付く知見・成果である。
この様に、軽鎖クローンの構造について大きな知見を得ることは出来たが、結晶化と構造解析は時間を要する検討である。また、上述の構造均一化に成功したことで、各クローンの性質を明確に見分けることが可能となった。この結果、酵素活性とアミノ酸配列の関係を議論出来る様になり、ライブラリーに対して実施した酵素活性のスクリーニングにおいて、着目すべき配置を複数見出した。Point mutationによりこの仮説を実証することが出来れば、抗体酵素化に結びつく技術と成り得る。
以上の様に、当初計画による成果のみならず、これまでの成果に基づいた検討により、抗体の抗体酵素化に向けた重要な知見を得たことから、「当初の計画以上に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)核酸分解型軽鎖クローン：構造を解いたのは軽鎖単独の構造であるので、オリゴヌクレオチドとの共結晶化を行い、回折実験へと進める。また、今年度の知見を元に、核酸と相互作用していると推定されたアミノ酸残基の変異体を作製し、酵素活性に変化が認められるか否かを調べる。また、このクローンはインフルエンザウィルスに対する感染抑制能を認めたものであることから、ウィルスを用いた実験系でも効果の変化を調べ、作用機序の解析へと繋げる。
(2)軽鎖クローンのアミノ酸配列と酵素活性の関係：今年度の知見を元に、活性に重要と推定した配列をAlaに置き換えたMutantの作製や、酵素活性を示さないクローンに対する特定残基の導入など、表裏の関係でMutantを作製して酵素活性試験データを蓄積する。
(3)軽鎖型抗体酵素の高活性化：これまでの検討から、「安定に酵素活性を発揮させるための構造」についての知見が集積してきた。これに基づき、抗体工学的な手法を導入して、高活性化を図る。具体的には、1)可変領域単独での発現、2)抗原認識部位の構造安定化や、疎水性相互作用による多量体化を防ぐための構造ユニットの付加を計画している。本検討においては、各種タンパク質の結晶化に造詣が深い大阪大学タンパク質研究所・高木淳一教授の協力を得て、研究を遂行する計画である。
(4)軽鎖クローン精製方法の改良：これまでの検討から、構造を均一化し、これを安定に維持させるための精製方法を確立した。この検討を進める過程に於いて、二次精製で実施するイオン交換クロマトグラフィー条件の酵素活性への影響を示唆するデータを得ている。pH条件の至適化を複数のクローンに対して実施して酵素活性との関連を明確にし、最終的に軽鎖クローンの標準的な精製方法として確立させる。
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Research Products
(20 results)
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[Journal Article] Experimental phase determination with selenome-thionine or mercury-derivatization in serial femtosecond crystallography2017
Author(s)
K. Yamashita, N. Kuwabara, T. Nakane, T. Murai, E. Mizohata, M. Sugahara, D. Pan, T. Masuda, M. Suzuki, T. Sato, A. Kodan, T. Yamaguchi, E. Nango, T. Tanaka, K. Tono, Y. Joti, T. Kameshima, T. Hatsui, M. Yabashi, H. Manya, T. Endo, R. Kato, T. Senda, H. Kato, S. Iwata, H. Ago, M. Yamamoto, F. Yumoto, T. Nakatsu
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Journal Title
IUCr J.
Volume: 4
Pages: 639-647
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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