2016 Fiscal Year Annual Research Report
再生内分泌組織の迅速応答を可能とする血流導入型ユニバーサル移植プラットフォーム
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16H02419
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
酒井 康行 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (00235128)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 大知 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (50447421)
田中 稔 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 細胞療法開発研究室長 (80321909)
太田 誠一 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (40723284)
國土 典宏 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (00205361)
稲垣 冬樹 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 外科医師 (70529015)
宮島 篤 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (50135232)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / 人工臓器 / 細胞・組織 / 移植 / 血管配備 / 内分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，移植による血流に耐えうる細胞培養デバイスを新規に開発し，iPS細胞由来の内分泌細胞を搭載することで，血液中のグルコース濃度に迅速に応答してインスリンを分泌する膵島再生デバイス，血中TSH（甲状腺刺激ホルモン）濃度に迅速に応答してT3・T4を分泌する甲状腺再生デバイスを構築することにある．プラットフォームとして，シリコーンシェル内に流路がパターンニングされたハイドロゲルの作製を行う．
本年度は，再生膵島組織モデルとして，マウスインスリノーマMIN6m9のスフィロイド作製を行った．さらにモデル膵島の播種法として，ゲル内に予め内分泌細胞を埋め込んだ封入型と，流路表面に内分泌細胞が格納されるマイクロウェルを作り込んだウエル型の２通りの構造を検討した．このためにゼラチンにメタクリレート基を修飾したプレカーサーポリマーを合成し，光架橋ゲルが作成できることを確認した．またコラーゲンをモールドに流下して風乾することでマイクロウエル構造を作る方法を検討した．さらにもうひとつの細胞固定化方法として，特殊な形状を持つ三次元多孔質担体を用いる手法についても検討を進めた．すなわち，直径約1 mm・高さ約1.5 mmの外形を持ち中空状の担体（いわゆるラシヒリング状の形態）をポリカプロラクトンの粒子を使った粉末焼結積層造形法にて造形した．
移植方法の検討のために，ラットの鼠径部大腿動脈を切除し，凍結保存した後，解凍して簡易的な脱細胞を行った後に，健常ラットの鼠径部に試験的に端々吻合を行った．
初年度は，計画通り，組織再生，デバイス開発，移植の各プロセスについて検討を開始し，2年目以降に以上を組み合わせて，デバイスの移植を行う準備が揃った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究においては，分化誘導，組織化，スキャフォールド，再生膵島とスキャフォールドのアセンブル技術，灌流培養，移植の確立の6つの技術が必要である．
内分泌組織として，iPS細胞からの膵島の分化誘導については順調に研究が滑り出した．一方で，ヒトES細胞からの分化誘導方法を参考にiPS細胞からの甲状腺濾胞細胞への分化誘導を試みたが，報告されている分化レベルには至らず，またその分化度に至るのでさえ再現性が非常に悪い状況が半年続いた．組織化はモデル細胞としてMIN6m9を用い，マイクロウエル培養によって球型の膵島モデルを作製した．ラシヒリング型については，この担体を用いて，モデル細胞としてのマウスインスリノーマMIN6 m9の三次元培養を行った．担体のコーティングには，コラーゲンやラミニン・ファイブロネクチンを試したところ，ラミニンコーティングにて，最大の初期付着率とその後の安定した増殖を得ることができた．このような三次元培養で，高グルコース濃度刺激時のインスリン分泌量は，二次元培養と比較して，数倍高いものであった．
スキャフォールドの作製として，光架橋性ゼラチンを合成し，ガラス基板モールドにフッ素樹脂コーティングを行うことで剥離容易にした基板上で，光照射によりゲル化を行い，ゼラチンゲルのモールディングが行えることを確認した．さらに移植方法の検討のために，ラットの鼠径部大腿動脈を切除し，凍結保存した後，解凍して簡易的な脱細胞を行った後に，健常ラットの鼠径部に試験的に端々吻合を行った．ヒト臨床において良く行われている方法の応用であり，本手法において長期間の血流は維持できないが，外科的手技の検討に成功した．
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は，再生膵島については，インスリンにGFPタグをつけたマウスインスリノーマMin6m9を京都大学より分譲を受けて，PDMSマイクロウエルにて培養し，膵島モデルからのインスリン分泌を蛍光観察で可視化可能とする．膵島β細胞のインスリン分泌能は，マトリックスや培養環境の影響を強く受けるために，インスリン分泌を可視化することで，デイバス開発を定量的かつ迅速に進める．3次元化とコーティング担体の最適化によってインスリン分泌能が飛躍的に向上することがわかっており，マイクロウエル培養において，ラミニン接着マイクロ粒子の導入検討を行う．
また甲状腺組織の再生については分化誘導の難しさから，既に分担者に実績のある膵島細胞に対象を絞り，まずはマウスの株細胞にて移植デバイスの構築と予備実験を行い，最終的にヒトiPS細胞由来の膵島の移植を行うこととする．
さらに前年度の光架橋ゼラチンを利用して，金属加工あるいは樹脂モールド上で光硬化反応によって，流路を持ったゼラチンハイドロゲルパターニングを行う．上下ゼラチンハイドロゲルの接着には新たにトランスグルタミナーゼを利用するプロセスを検討する．また新たにゲルディスペンサーを導入し100μmレベルでの吐出精度での塗工を検討し，モールドレスなプロセスも同時並行で検討する．
移植モデルについては，今年度新たにストレプトゾシン皮下注による糖尿病ラットモデルにおいて，別ラットの鼠径部大腿動脈を切り出し，鼠径部に試験的に端々吻合を行う．今年度から，レシピエントラットに人工血管生体内組織形成術（IBTA）を施し，これを鼠径部に試験的に端々吻合を行う．3年目以降に，IBTAで得られた再生人工血管中に再生膵島を封入することで，本研究の目標達成を目指す．
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[Presentation] Differentiation of functional islets from human iPS cells and hiPS-endocrine progenitor cells in vitro.2016
Author(s)
Ami Watanabe, Anna Tanaka, Hiroyuki Otsubo, Masahiro Ohta, Yzumi Yamashita-Sugahara, Kohnosuke Mitani, Mahito Nakanishi, Yasushi Okazaki, Atsushi Miyajima
Organizer
International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 2016
Place of Presentation
Moscone West, San Francisco, California, USA
Year and Date
2016-06-22
Int'l Joint Research
