2016 Fiscal Year Annual Research Report
微小管構築に必須な進化上保存された新規経路の空間・時間的制御機構
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16H02503
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
登田 隆 広島大学, 先端物質科学研究科, 特任教授 (50197894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湯川 格史 広島大学, 先端物質科学研究科, 助教 (50403605)
西 晶子 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (50772422)
上野 勝 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (90293597)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 微小管 / キネシン / アンカー因子 / 染色体分配 / サプレッサー / 全反射照明蛍光顕微鏡 / 分裂酵母 / 進化保存 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞骨格微小管は、染色体分配・細胞極性・細胞運動などに重要な機能を持つ。これまで行われてきた多岐にわたる研究により、多様な微小管制御機構が明らかにされてきた。しかしながら、重合核である中心体に微小管を係留（アンカー）する分子機構の知見は皆無であった。申請者は先に分裂酵母を用いて、アンカー因子（Msd1-Wdr8-Pkl1複合体）を世界で初めて同定した。
本基盤研究（A）では、平成２８年度中に計画した３つのプログラムについて鋭意研究を遂行し、次に示した成果を上げることができた。
１）14型キネシンPkl1の生化学的解析：分裂酵母１４型キネシンPkl1、および微小管アンカー因子Msd1タンパク質を大腸菌で発現させ、それぞれ単一標本として精製することに成功した。現在Pkl1のATP依存的モーター活性、およびMsd1がPkl1に及ぼす影響について、全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡を用いて生化学的・生物物理学的に解析している。
２） MWPと相互作用する新規タンパク質の検索：１４型キネシンPkl1と拮抗的に機能する５型キネシンcut7温度感受性変異株を抑圧するサプレッサー変異体を多数（＞５０株）分離した。現在そのサプレッサー遺伝子を同定するため、次世代シークエンシングによって全ゲノム配列を決定中である。mwp変異体がcut7温度感受性株をサプレスすることから、これらサプレッサー遺伝子はMWPタンパク質と相互作用する、あるいは新規のアンカー因子をコードしていると期待される。
３）Msd1、Wdr8に含まれる構造ドメインの機能解析：msd1,wdr8遺伝子にランダムに変異を導入することによって、この二つのタンパク質における機能必須領域の同定を図っている。すでにMsd1のコイルドコイル配列とWdr8のWD40繰り返し領域が必須機能を持つことが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績で前述した各プログラムについて、現在の進捗状況を具体的に記す。
１）生化学的解析：分裂酵母１４型キネシンPkl1はN末端のテイル領域(N)、中央のヒンジ部(M) C末端の微小管結合モーター領域(C)からなる。GFPが結合した大腸菌発現ヴェクターに全領域（N＋M＋C）、N+M,M＋Cの３つの領域をコードするDNA断片をつなぎ、BL21株を用いてタンパク質発現を試みた。全領域N＋M＋Cが、過度のタンパク質分解のためその精製に工夫が必要であったが、インキュベーション時間・IPTG濃度・バッファー条件をそれぞれ検討することによって、最終的にN＋M＋C、N+M,M＋Cの３つのタンパク質の単品精製に成功した。次のステップは全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたPkl1タンパク質のATP依存的モーター活性測定と微小管上でのその方向性決定である。またMsd1全長タンパク質の大腸菌での発現・精製にも成功したので、Pkl1とMsd1タンパク質をin vitroで混合することによって、これら二つのタンパク質が直接結合するか、またMsd1添加によってPkl1のモーター活性に変化が起こるか、詳細に調べていく予定である。
２）MWPと相互作用する新規遺伝子の同定：cut7変異体サプレッサーを５０株以上分離した。現在そのサプレッサー遺伝子の同定を次世代シーケンスで試みている。予備的結果であるが、サプレッサーの一つはpkl1遺伝子であることが判明した。これは本プログラムの遺伝学アプローチが予想通り働いていることを証明する結果である。残りのサプレッサー同定についても鋭意遂行中である。
３）Msd1、Wdr8の構造ドメイン解析：Msd1のコイルドコイル配列とWdr8のWD40繰り返し領域が必須機能を持つことが明らかになった。これら以外の領域が機能に必須かどうか決定するため、さらなる変異体を作成している。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）14型キネシンPkl1の生化学的解析：分裂酵母１４型キネシンPkl1のモーター活性検出が今後の最も重要な課題である。Pkl1はそのモーター領域がタンパク質C末端に存在するので、微小管上をマイナス方向に移動するモーターであると予想できる。これを実験的に証明するのが次の第一歩となる。分裂酵母を用いた遺伝学、細胞生物学的解析からMsd1はPkl1を正に制御する因子であることが予想される。その制御機構をin vitro系を用いて追求していきたい。Msd1がPkl1のモーター活性をいかに制御するか、また微小管結合能に対する影響はどうかという点について詳細な検討を加える予定である。
２）MWPと相互作用する新規タンパク質の検索：５型キネシンcut7温度感受性変異株を抑圧するサプレッサー変異体 株（＞５０）の全ゲノム配列を次世代シークエンシングによって決定することが第一に到達しなければならない課題である。もし予想通り、MWP以外の遺伝子・タンパク質が同定されれば、それらの細胞内機能についてーとりわけその微小管アンカー機能についてー解析を鋭意進めていく。
３）Msd1、Wdr8に含まれる構造ドメインの機能解析：Msd1、Wdr8の構造ドメインに関する機能情報に基づいて、生化学的解析によりMsd1-Wdfr8-Pkl1の３つのタンパク質の相互作用マップ、すなわち各領域のどのアミノ酸残基がタンパク質―タンパク質相互作用に関与するかを、分子レベルで明らかにしたい。
４）MWPのヒトにおける機能保存の検証。：ヒトにおけるMWP複合体存在の検証に関しては、現在プラスミド、大腸菌株の準備が整いつつある。平成２９年度にこのプログラムについても成果を得る予定である。
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[Journal Article] An unconventional interaction between Dis1/TOG and Mal3/EB1 in fission yeast promotes the fidelity of chromosome segregation2016
Author(s)
Matsuo, Y., Maurer, S. P., Yukawa, M., Zakian, S., Singleton, M. R., Surrey, T. and Toda,
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Journal Title
J Cell Sci
Volume: 129
Pages: 4592-4606
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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