2018 Fiscal Year Annual Research Report
微小管構築に必須な進化上保存された新規経路の空間・時間的制御機構
| Project/Area Number |
16H02503
|
|---|
| Research Institution | Hiroshima University |
|---|
Principal Investigator |
登田 隆 広島大学, 先端物質科学研究科, 特任教授 (50197894)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
湯川 格史 広島大学, 先端物質科学研究科, 特任助教 (50403605)
西 晶子 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (50772422)
上野 勝 広島大学, 先端物質科学研究科, 准教授 (90293597)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 微小管 / 細胞分裂 / 染色体分配 / 中心体 / キネシン / 分裂酵母 / 機能互換性 / 動原体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞骨格微小管は、径25nmの中空ポリマーからなる繊維状構造を形成し、発生過程、細胞分裂過程で種々の形態をとることによって、染色体分配・細胞極性・細胞運動などに重要な機能をもつ。細胞周期M期中期では双極性紡錘体形態（スピンドル）を取り、プラス端が染色体上の動原体（キネトコア）、マイナス端が中心体（セントロソーム、酵母ではスピンドル極体、SPB）と結合する。 M期後期への移行に伴い、キネトコア微小管が脱重合し、染色分体を二つの娘細胞に分配する。近年の分子生物学の進展により、微小管プラス端における制御機構に関する研究は大きく進展したが、マイナス端制御-とりわけ中心体・SPBへの安定な係留機構に関する分子レベルの理解は乏しかった。申請者は、分裂酵母、ヒト、ゼブラフィッシュを材料に、これまでスピンドル微小管マイナス端の中心体・SPBへの係留機構を追求してきた。本基盤研究（A）では、微小管マイナス端動態制御の分子メカニズムの解析を通して、双極性微小管形成新規経路の同定とその生物学的意義の解明を研究目的とした。
平成30年度は、分裂酵母を用いて次の３つプログラムについて研究を遂行し、それぞれ成果を上げることができた。(1) 5型キネシンCut7の温度感受性変異体の網羅的な分離とサプレッサー遺伝子の解析。微小管安定化因子に変異が起きるとcut7温度感受性が抑圧されることを見出した。(2)6型キネシンKlp9の生物物理学解析とその細胞周期M期における役割解析。Klp9がプラス端方向性のモーター活性をもち、M期終期における微小管伸長を促進することを示した。(3)ヒトと分裂酵母14型キネシンの機能互換性。ヒト14型キネシンHSETを分裂酵母で発現させたところ、分裂酵母14型キネシン欠損を相補できることが判明した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)5型キネシンCut7の温度感受性変異体の網羅的な分離とサプレッサー遺伝子の解析。
cut7温度感受性株cut7-22を36°Cで培養し、高温下条件でコロニー形成できる復帰株を計25株、分離した。遺伝解析の結果、それらのサプレッサー変異は、3株が遺伝子内変異で22株が遺伝子外変異であった。次に、既知のサプレッサー株（pkl1, msd1, wdr8）と掛け合わせたところ、14株（それぞれ7株、2株、5株）がこれらの座位であった。残り8株の新規サプレッサー遺伝子を同定するため、次世代シーケンサーで全ゲノム配列を読み、変異遺伝子の検討を行った。その結果、3株は、チューブリン遺伝子（atb2, nda3）、微小管結合タンパク質（mal3）変異であった 。すなわち、本研究からCut7は双極性微小管を形成させる際に、微小管重合、伸長を負に制御する機能があるという新知見を得ることができた。
(2)6型キネシンKlp9の生物物理学解析とその細胞周期M期における役割解析。Klp9のM期における役割は不明であった。今回、全反射照明蛍光顕微鏡を用いて、Klp9タンパク質の物理化学的性質を精査した。その結果、Klp9は微小管上をプラス端方向に移動するモーター活性をもつことが明らかになった。また遺伝学的、細胞生物学的解析から、Klp9はCut7と協調して、M期終期（anaphase B）におけるスピンドル伸長に必須機能を有することがわかった 。
(3)ヒトと分裂酵母14型キネシンの機能互換性。ヒト14型キネシンHSETの細胞内機能は不明な点が多い。今回(i)HSETが分裂酵母内でマイナス端方向性モーターとして機能し、(ii)分裂酵母14型キネシン欠損（pkl1,klp2破壊株）を相補し、(iii)過剰発現させると、中心体（SPB）不分離を惹起して細胞を致死にいたしめることが明らかになった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
(1)5型キネシンCut7の温度感受性変異サプレッサー遺伝子の包括的解析。
最近の次世代シーケンス解析から、現在cut7温度感受性変異サプレッサーとして、さらに４つの新規遺伝子が同定された。興味深いことにそのうち二つは、RNA結合領域(RRM)を有する進化上保存されたタンパク質をコードしていた。そこで来年度はこれらRNA結合タンパク質の微小管構築への関与について、解析を行う。特に、(i)RRMがCut7機能の抑制に必要か、(ii)細胞内局在の決定、(iii)ターゲットRNA分子の同定、の３点について実験を進める計画である。
(2)Cut7がスピンドル微小管安定性を制御する機作の解明
cut7変異体におけるスピンドル微小管の輝度を定量したところ、興味深いことに、顕著な上昇が観察された。さらにcut7変異体が微小管脱重合薬剤に対して耐性となることも分かった。すなわち、Cut7にはスピンドル微小管を不安定化させる機能が示唆された。そこで微小管不安定性がどのレベルで誘起されているのか？：最初の重合反応かあるいは重合後の伸長過程なのかをまず実験的に検証する。もし重合過程であるなら-チューブリン複合体とCut7の相互作用について調べる。もし伸長過程であるなら、他の微小管結合タンパク質とCut7の関連について精査する。
(3）酵母-ヒト間のキネシン分子の機能保存検証。
前年度ヒト14型キネシンHSETが分裂酵母内で機能できることを示した。来年度は、ヒト５型および6型キネシン（Eg5/KIF11およびMKLP1, MKLP2）を分裂酵母内で発現させて、機能互換性の検証を行う。もし互換可能であれば、5型、6型、14型キネシンを人型のものに置き換えたhumanised分裂酵母の作成が可能となる。分裂酵母を用いてヒトキネシン阻害剤、その制御機構の解析が可能となることが期待される。
|
